抗菌药物敏感性试验(药敏试验).ppt

1、抗菌药物敏感性试验（药敏试验）,内 容,简介 药物选择及报告 K-B 法 操作方法 报告方式 影响因素 稀释法 E test 联合药敏试验 2010年CLSI更新内容简介,目的,指导临床医生针对各类临床感染患者选择最佳抗菌药物 一定区域内积累对公共卫生有关的重要耐药的微生物流行病学资料,根据细菌对药物敏感谱进行菌种鉴定,药敏试验原理,把含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试细菌的琼脂平板上 纸片中药物吸收琼脂水分溶解后通过弥散作用形成递减的浓度梯度,纸片扩散法,纸片周围一定距离范围内试验菌生长受抑制，从而形成无菌生长的透明圈即抑菌环。 抑菌环大小反映测试菌对测定药物的敏感程度 抑菌环大小除与细菌

2、的敏感性有关外还与其它诸因素相关。,定量测定抗菌药物活性 抗菌药物与肉汤或琼脂培养基混合稀释后种入试验细菌，孵育过夜。 以能抑制细菌生长的最低浓度为最低抑菌浓度（MIC） 将MIC与机体血清或体液中可获得药物浓度相比较来确定恰当的临床疗效,稀释法,MIC的对数与抑菌环直径关系 近似线性负相关,CLSI药物选择原则,A组 常规和首选药物，其结果应常规报告 B组 首选试验选择性报告。包含一些临床上重要的、特别针对医院感染的药物 C组 替代性和补充性药物 U组 补充性试验，仅用于治疗泌尿道感染的抗菌药物。,表中小框内是一组类似药物，其结果解释和临床效力相似，不必个个试验。 “或”字表示一群相关药物，

3、其抗菌谱和解释结果几乎完全相同，交叉耐药性和交叉敏感性也完全相同，通常只选择一种药进行试验。,药物选择,药敏试验中常用试验药及其代表的药物,所有菌属,试验药物,林可霉素,克林霉素,B组药物,细菌对A组同类药物耐药，可选择性报告 报告指征 特定的标本来源 多种细菌感染 多部位感染 对A组药过敏、耐受或无效 以流行病学调查为目的向感染控制部门报告,C组药物,某些医院潜在局部或广泛流行的耐药菌株对数种手选药物（特别是同类的如-内酰胺类或氨基糖甙类）耐药 治疗对基本药物过敏的患者 治疗少见菌的感染 流行病学调查为目的向感染控制部门报告,试验方法纸片扩散法,改良Kirby-Bauer法(K-B法),培养

4、基 非苛氧菌用Mueller- Hinton（M-H）琼脂 药物纸片 直径6mm纸片，每片吸水量约20l 菌液比浊管 0.5号麦氏（McFarland）标准比浊管， 菌液浓度为1.5108/ml 质控菌株 金黄色葡萄球菌 ATCC 25923 大肠埃希菌 ATCC 25922 铜绿假单胞菌 ATCC 27853,试验材料,操作方法,菌液制备 挑取已纯化的45个菌落制备菌悬液 挑选琼脂平板上35个形态特征一致的菌落，用接种环接触每个菌落顶部 转移至45mL 适宜的液体培养基中（如胰酶消化大豆胨肉汤）,生长法,置35孵育2-6 h 用无菌生理盐水或肉汤校正，使其浊度至0.5号麦氏管,从孵育16-2

5、4h 的非选择性琼脂培养基上用接种环挑取单个新鲜菌落，悬浮于生理盐水或肉汤中震荡混匀 与标准比浊管比浊，以有黑字的白纸为背景调整其浊度相当于0.5号麦氏管。,直接调制菌悬液法,生长法的简便替代法,用无菌棉拭子蘸取菌液 在管壁上方旋转挤压几次去掉过多水分 用拭子涂布整个M-H培养基表面，反复几次，每次将平板旋转60 最后沿平皿周边绕两圈以保证涂布均匀,平板接种,制备好的菌液必须在15min内使用 贴纸片前可将培养皿盖半开3-5min以使表面过多水分被吸收但不超过15min,将接种好的平板敞开盖子倒置在室温下干燥3-5min 使平板上的水分被琼脂完全吸收。 用镊子取纸片一张贴在琼脂平板表面，轻压使

6、其与琼脂完全接触。纸片中心间距24mm,纸片中心距平皿边缘15mm。直径90mm的平板最好贴6张。,加贴纸片,15min内将平板倒置放温箱孵育。,纸片一旦贴下就不可再挪动位置，因纸片中的药物已扩散到琼脂中。 需要时应在适当的地方贴新纸片,注意,必须用35孵箱（苛氧菌药敏平板应置于5% CO2 环境） 箱内平板最好单独摆放，不超过两个叠在一起，否则中间的平板因达不到孵箱温度而产生预扩散的作用。,孵育,平板孵育规定时间（一般为18-24h）后读取结果，葡萄球菌和肠球菌必须孵育24h以检测苯唑西林和万古霉素的耐药性。,孵育16-18h 后检查每一块平板 如果划线满意，接种物准确无误，抑菌圈应为正圆形

7、，菌落应融合生长 出现明显单个菌落表示接种量太少 重复试验,可用直尺或游标卡尺，读取最接近的整毫米数 测量时应将尺子置于倒置的平板上，置平板在黑色无反射光背景上方几厘米处并用反射光照明。 含血的药敏琼脂 应移去平板盖后用反射光照明平板，于表面上方测量抑菌环。,抑菌环直径测量,测量抑菌环直径时 抑菌环边缘以见不到细菌明显生长为限，测量的是完全抑制的区域直径（包括纸片直径） 按抑菌环直径判断细菌的敏感性，应依据CLSI的解释标准，报告细菌对测试药物敏感、中介、耐药。,在清楚抑菌环内有独立的菌落生长提示 接种的菌落不纯，需要重新分离、鉴定和药敏试验 抗菌药物选择出的高频突变耐药株,结果判断,变形杆菌

8、属的菌株可扩散到某些抗菌药物的抑菌环内，故在明显抑菌环内有薄膜状爬行生长可以忽略。 链球菌应检测其生长抑制圈而非溶血抑制圈。,对于甲氧苄啶和磺胺，拮抗物使细菌轻微生长故抑菌圈直径应忽略细微生长的菌落。 来自血琼脂菌落可能带有足够的甲氧苄啶或磺胺拮抗物，在SXT抑菌圈内细菌可沿敏感菌株周围产生模糊生长。,检测苯唑西林和万古霉素对葡萄球菌和肠球菌的抑菌环需要用透射光（平板对着光源），抑菌环的边缘用放大镜才可发现小菌落可以忽略。 在纸片周围的抑菌环内有任何可辨的菌落或生长薄膜（包括针尖样菌落）提示耐药。,报告方式,敏感 菌株能被使用推荐剂量在感染部位达到的抗菌药物浓度所抑制,常规报告,中介 被测菌株

9、对该药物的MIC接近于血液、组织中通常可达到的浓度而治疗反应率可能低于敏感株。意味着可通过提高剂量或在药物被生理浓集的部位发挥临床效力。,被测菌不能被该抗菌药物的常用剂量在组织或血液内达到的浓度所抑制 其MIC落在某些范围内提示该菌可能存在特定的耐药机制（如-内酰胺酶）而且治疗研究表明其临床疗效不可靠。,耐药,当药物对菌株的MIC高于或抑菌圈直径低于敏感折点时报告为非敏感。 非敏感并不意味着菌株携带某种耐药机制。 由于耐药菌株缺失或稀少因而仅确立了敏感性解释标准。 对于“不敏感”菌株，鉴定和药敏结果需再次确认。,不敏感（NS） M100-S20定义,解释性报告 某些菌种或菌群对抗菌药物的选择和

10、报告有特殊要求 大肠埃希菌和克雷伯菌属中产ESBLs菌株应报告对所有青霉素类、头孢菌素类及氨曲南耐药。,对沙门菌属和志贺菌属的分离株 只有氨苄西林、一种喹诺酮类药物和磺胺异恶唑/甲氧苄啶可用于常规试验和报告 第一、二代头孢菌素和氨基糖甙类药物体外可能有活性但临床无效故不应报告敏感,沙门菌属的肠道外分离株应测试并报告氯霉素和一种三代头孢菌素的敏感性 肠球菌对头孢菌素类、氨基糖甙类、磺胺甲恶唑/甲氧苄啶和克林霉素在体外可能有活性但临床耐药，不能报告敏感。,MRS应报告耐受所有-内酰胺类药物（包括其复合药） 从威胁生命的感染（脑膜炎、菌血症、会厌炎和面部蜂窝组织炎）患者的血和脑脊液中分离的流感嗜血杆

11、菌常规应报告氨苄西林、一种三代头孢菌素和氯霉素的药敏结果。,“警 告” 下列抗生素/微生物组合，在体外可出现活性,但在临床上无效 ，不应报告敏感,苛养菌药敏试验,培养基为HTM（嗜血杆菌试验培养基） 常规试验并不推荐用M-H巧克力琼脂 过高的接种浓度对某些-内酰胺类抗生素可造成假耐药的结果 相当于0.5号麦氏管含菌14108CFU/mL,嗜血杆菌,HTM,氯化血红素母液 氯化血红素50mg溶于100ml 0.01mmol/L的NaOH，加热搅拌至完全溶解。 NAD母液 NAD50mg溶解于10ml蒸馏水，过滤除菌。,HTM,30ml氯化血红素母液加至1L含5g酵母粉的M-H琼脂中 高压灭菌 冷

12、却后用无菌手续加入3ml的NAD母液,淋病奈瑟菌,培养基 GC琼脂+1%的特定生长添加剂 不推荐用高营养的巧克力琼脂作药敏 若10g青霉素纸片抑菌圈19mm ，表示产生-内酰胺酶。 -内酰胺酶试验更为迅速，为确认质粒介导耐药性的好方法。,培养基 含5%脱纤维羊血的M-H琼脂 肺炎链球菌用苯唑西林测定对青霉素的敏感性，抑菌环直径19mm应测其MIC而不是直接报告对青霉素中介或耐药,肺炎链球菌和其他链球菌,肺链以外的链球菌不推荐用苯唑西林试验 对于草链，青霉素（或苯唑西林）纸片扩散试验是不可靠的，无菌部位分离的草链应测其青霉素的MIC。,适用于肠杆菌科细菌等快速生长的致病菌 无论哪种接种方式，只要

13、质控菌种的抑菌环在预期范围内，均可按同一解释标准报告药敏结果 为WHO推荐药敏方法 专性厌氧菌及酵母样菌等某些特殊菌种药敏试验不能用,纸片法特点,技术简单，试剂量低，不需要特殊设备，可自由选择抗菌药物，可重复，易于由人判断，故必须标准化。 纸片法药敏试验必须标准化,影响因素,M-H 培养基,批间重复性较好 含有磺胺、甲氧苄啶和四环素的抑制物很少 绝大多数非苛养菌生长良好 已积累大量的数据和经验,按商用脱水培养基说明制备 高压灭菌后水浴冷却至45-50 水平台面上倾注平皿，厚度均匀一致约4mm，150mm平皿倒 60-70mL，100mm平皿倒 25-30mL,培养基配制,冷却至室温，若当天不使

14、用应贮存于 2-8冰箱 制备后7天内使用完毕 每批平板均应进行抽样进行无菌试验，30-35孵育24h或更长时间。,检查每批 M-H琼脂的pH，胶化后室温下为7.2-7.4 过低、过高会使某些药物失去效力（如氨基糖甙类和大环内酯类）或活性可能增强（如青霉素类）。,pH,若使用前琼脂表面过分潮湿，应放35孵箱或在室温下敞开盖子倒置，直至多余水分蒸发。 琼脂表面应保持湿润 在接种后琼脂表面或平板的盖子表面不应有可见的潮湿水珠,湿度,过量胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶可逆转磺胺类和甲氧苄啶的抑菌效应而使抑菌环变小、模糊甚至消失而导致假耐药的报告，应使用胸腺嘧啶核苷含量尽可能低的M-H琼脂。 评价新的M-H琼脂

15、可用甲氧苄啶/SMZ纸片对粪肠球菌ATCC29212或粪肠球菌ATCC33186进行试验,胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶影响,不合格培养基 没有抑菌圈 抑菌圈内有菌生长 抑菌环直径20mm 合格培养基 培养基上出现边缘清楚的抑菌环 直径为20mm或更大,主要指镁和钙 影响氨基糖甙类、多粘菌素和四环素对假单胞菌的试验结果 含量过高 抑菌圈变小 含量过低 抑菌圈变大甚至不可接受 锌离子主要影响细菌对碳青霉烯的敏感性,二价阳离子含量的影响,培养条件,非苛氧菌解释标准的基础是在空气中孵育。 某些药物（氨基糖甙类、大环内酯类和四环素）受CO2 影响抑菌环直径会有较大改变，非苛氧菌不能在CO2 浓度较高的环境中孵

16、育。 苛氧菌应在CO2 环境孵育中,纸片的贮存,装有纸片的容器应置于非无霜冰箱中， 8冷藏或-14冷冻至使用前 某些不稳定药物（如亚胺培南、头孢克洛、克拉维酸复合药等）也应冷冻保存直至使用当天，以尽量保持其稳定性。,装有纸片的密封容器应于使用前1-2h移出冰箱，平衡至室温后才能打开以防热空气接触冷纸片时产生冷凝水。 装有纸片的塑胶管从密封包装中取出后应置于密封的干燥容器中 -内酰胺类药物纸片应密封包装并冷冻，少量正在使用的纸片可冷藏至少一周,使用纸片分配器应上紧盖子并配备足量干燥剂，分配器打开前应平衡至室温；指示剂变色时应更换干燥剂以防过于潮湿。 装有纸片的分配器不用时应冷藏 过期纸片不得使用

17、，应废弃。,接种物的浊度,使用BaSO4浊度标准管或其光学等同物（如乳胶颗粒悬液） 相当于0.5号麦氏标准管(配制方法见后）,使用前将浊度标准管取出置于旋转混匀器上剧烈振动，目测其外观浊度应均匀一致 出现大颗粒浊度管应更换 每月应更换硫酸钡浊度管或核实其浊度,0.048mol/L的BaCL2 0.5mL （1.175% w/v BaCl2 H2O）加入到99.5mL 0.18mol/L的H2SO4（1% v/v），并不断搅动以维持混悬状态。,0.5号麦氏标准管配制,按每管4-6mL分装于带螺帽的试管，其口径应与稀释菌所用一致。 密封并贮存于室温黑暗处 可使用分光光度计核实浊度标准管的浊度，光径

18、1cm，625nm吸光度值0.08-0.10者即为0.5号麦氏标准管。,注意事项,对每种可能致病的细菌进行药敏试验时，使用的单个菌落应选自原始琼脂平板 多种不同型细菌的混合物不能在同一药敏试验平皿上进行试验 直接用临床标本药敏试验须经分纯菌种药敏试验复核,接种物浓度避免过浓或过稀 禁止用未稀释的过夜肉汤或其他非标准接种物进行平板划线 必须应用标准化操作方法并测量抑菌环直径，绝对不允许只凭环的有无而不考虑环的大小判断结果。,试验方法稀释法,琼脂稀释法 重复性好 同时测定多种细菌 可观察被检菌落生长情况、发现污染菌 可应用机械化手段、提高效率,微量肉汤稀释法 一块板可以同时测定多种抗菌药物 操作规

19、范、简便、结果可信 药物不一定适合实际工作需要,试验方法E test,是一种抗菌药物浓度梯度法直接测量MIC的药敏试验 结合了稀释法和扩散法原理、特点并克服两者缺点 结果准确、重复性好、操作简便,原 理,E试条为5mm*50mm的长条，一面固定有预先制备的稀释度呈指数级连续增长的抗菌药物；另一面有读数和判别刻度。 抗菌药物梯度可覆盖20个等倍稀释度 试条贴在涂有细菌的琼脂平板上孵育后其周围可见椭圆形抑菌环，边缘与试条交点的刻度称为抑制浓度（IC）。,方 法,培养基和菌种 同纸片法 贴试条 确保已接种细菌的平板干燥 用镊子将试条刻度面朝上放入使之与琼脂紧密接触 药物最高浓度处应靠平板边缘 轻压以

20、驱赶其下方气泡 孵育 时间和环境要求参考说明书,结果解释,无抑菌环，IC最大浓度； 抑菌环延伸至试条下方、与试条无交点，IC最小浓度 应排除薄雾状和散在菌落，读取完全抑制处数值。 IC与CLSI的MIC高度相关、直接对应。,联合药敏试验,为确定两种药物之间是否存在拮抗或协同作用，需用联合敏感试验进行测定， 以便临床选择有效的抗生素 方法 纸片法 平板纸条交错法 梯度纸条试验法,纸片法,与单片纸片扩散法相类似 即将两种含药纸片贴于已接种被检菌株的平板上，相距23 mm。 置于35C培养1824 小时 根据呈现的抑菌图形报告“协同”、“无关”或“拮抗作用。,协同作用,相加作用,拮抗作用,无关作用,

21、CLSI 2010更新内容简介,表1A“建议分组” 肠杆菌科细菌头孢噻吩,CLSI M100-S20.2010 Group U,CLSI M100-S19.2009 Group A,为什么头孢噻吩被移动位置,在美国，注射头孢噻吩已经无效 口服头孢噻吩主要用于肠杆菌科细菌尿路感染的治疗；仅尿路感染分离株报告头孢噻吩结果。 头孢噻吩敏感性测试可以代表其他口服头孢菌素类头孢羟氨苄,头孢泊肟,头孢氨苄,氯碳头孢,肠杆菌科折点已修正(MIC g/ml),CLSI M100 -S20. Table 2A.,肠杆菌科细菌折点未修正，有待评估(MIC g/ml),CLSI M100 -S20. Table 2

22、A.,肠杆菌科折点修正 (纸片法 mm),为什么头孢唑啉没有纸片法折点？,所研究地区范围内头孢唑啉MIC折点无可靠结果 需要进一步深入研究 纸片药物浓度有待修正,为什么CLSI降低肠杆菌科细菌头孢菌素和氨曲南的折点？,先前的折点是20多年前制定的 加强了对以往的和新-内酰胺酶耐药机制的认识，以及加上ESBLs的加入 确定折点有了新方法 药代动力学和药效动力学（PK/PD),折点无需再评估,在美国，大多药物都买不到或者没有批准使用 对于E.coli，Klebsiella spp.和Proteus mirabilis，检测他们中的任何一个，都必须继续完成ESBLs筛选和确证实验 如果ESBLs阳性

23、，要把cephalosporins、penicillins、 aztreonam敏感的结果改为耐药,头孢孟多 头孢尼西 头孢哌酮 拉氧头孢,肠杆菌科修正后的碳氢酶烯类折点（MIC ug/ml）,ESBLs检测（1）,最初的方法来源于： 某些分离株在敏感范围内提高了MIC值 得到关于病人的产ESBLs的分离菌株的数据结果有限 对大肠埃希氏菌，克雷伯均属，奇异变形杆菌进行ESBLs的筛选和确证实验,ESBLs检测（2）,ESBLs表型检测不是最理想的 在做确证实验时，多重耐药机制的出现会掩盖ESBLs 例如 -ESBLs+AmpC -ESBLs+porin mutation ESBLs出现在除E.

24、coli，Klebsiella spp.，Proteus mirabilis之外的其他肠杆菌科细菌某些种时确证实验并不可行 一些实验室不做检测 相对于耐药机制的认识，MIC与统计输出结果关系更密切,ESBLs检测（3）,非肠杆菌科细菌,不动杆菌属,将黏菌素和多粘菌素B从实验报告C组中删除。,删除铜绿假单胞菌关于青霉素类的解释,对这类药物敏感的种类提示需要一个高浓度治疗铜绿假单胞菌引起的严重感染。针对这些感染，单一疗法往往造成临床治疗失败。应考虑加入体外实验对铜绿假单胞菌有抗菌活性的抗生素，例如喹诺酮类和氨基糖苷类,葡萄球菌属,万古霉素MIC,CLSI M100-S20(2010),万古霉素纸片

25、扩散法无抑菌环(=6mm)可检测含VanA的金黄色葡萄球菌分离株 万古霉素抑菌环=7mm，必须检测其MIC值 纸片扩散法测万古霉素不可靠 检测到万古霉素MIC=8ug/ml的任何金黄色葡萄球菌，应送往参考实验室,增加Linezolid耐药折点,Linezolid不敏感的S.aureus罕见0.05%(7 / 15,280 isolates) CLSI agenda book June 2009 耐药机制已经确定 rRNA突变、介导耐药（能被质粒编码） Mendes et al. 2008. Antimicrob Agents Chemother. 52:2244.,增加 MRSA的定义,MRSA就是金葡的某些菌株表达mecA基因或是其他耐甲氧西林机制，比如与青霉素结合蛋白亲和力的改变。,关于mecA阴性MRSA,机制 修饰青霉素结合蛋白位点(PBPs) 1,2,4 (MOD -SA) 编码blaZ的青霉素酶过度表达 Methicillinase？ 罕见 文献里临床资料有限 re: 有关-内酰胺类药物的治疗 Croes, S et al. 2009. Clin Microbiol Infect. Epub. 10/09 Chambers, H. 1997. Clin Microbiol Rev. 10:781.,S. aureus or S. L