DNA多态性及其分析.ppt

1、DNA多态性及其分析技术,免疫与分子生物学技术研究室 董 燕,广州中医药大学 临床药理研究所,第一节 多态性概述,一定义 自然界的生物有千百万种，每一种生物的个体之间存在着许多的差异。一种生物群体内，某一性状方面也存在着不同的个体变异。 不同种的生物以及同一种生物的不同个体之间都存在着许多差异，称为生物的多态现象，即生物的多态性。（polymorphism）,环境因素,遗传因素,营养、气候、疾病等,遗传多态性,生物进化,遗传多态性（genetic polymorphism） 不同个体之间，其生化特征、抗原特性都存在着由遗传造成的变异，形成一系列的多态性，由相应的基因控制。,二标准,基因座位：基

2、因在染色体上的位置 等位基因（alleles)：二倍体个体中，位于一对同源染色体相等位置上（相同座位上），控制着同一性状的基因，具有两种或两种以上的形式。 纯合子：二倍体中，在一定的座位上带有两个相同的等位基因的个体。 杂合子：在一定的座位上带有两个不同的等位基因的个体。（一般是针对所研究的一对或几对基因而言。）,多态性：发生遗传分离的基因座位（locus）具有两个以上等位基因时，其最常见的等位基因的频率不超过0.95或0.99时，这个基因座位就被认为具有多态性。 个人一对等位基因（如1 /2 ，或2 /3） 人群复等位基因（如1 、2 、3、 4）,如 ABO血型基因、人类白细胞抗原基因 二

3、态性（dimorphism）：在某些时候，一个基因位点上只由一个基因占据，但有时这个位置上缺乏这一基因，这时就会出现“有”和“无”两种情况，被称为二态性。,遗传多态性广泛存在于生物界。 果蝇有着大量的蛋白质水平上的遗传变异 哺乳动物的免疫球蛋白有高度的遗传多态性 即使是纯系的小鼠，其免疫球蛋白IgG2a重链编码区1108个碱基中就有110个（10%）的碱基组成互不相同，其中有18个碱基替换是同义的，其余的变异则编码不同的氨基酸。,三分类,遗传表型的多态性,DNA的多态性,由遗传控制表现出来的性状就是遗传表型 红细胞表面的抗原多态性系统：有ABO、Rh等20余种 人类白细胞抗原（HLA）系统 人

4、类的免疫球蛋白,性状：生物体表现出的形态特征（如花色）和生理生化特征（如抗病性、合成某种物质的能力)。 表型：个体所具有的全部或部分性状。是基因型与环境作用的结果。,人30亿碱基（bp),基因及相关序列20%30%编码序列10%检测表型多态性,非基因序列 70 80%,中度或高度重复序列20-30% 单一或低拷贝序列70-80%,在所有生物体的基因组中都存在着天然的DNA序列变异 由于基因组的大多数序列不编码蛋白质，因此可容纳大量的序列变异 估计在人群个体之间每200400个核苷酸就能检测到一个核苷酸的变异。 某一变异的群体频率达到或超过1%即被认为属DNA多态性。,遗传表型的多态性只反映出编

5、码基因的部分变异 DNA序列中的同义突变不会引起表型的改变 基因的表达也会有变异： 环境作用 从基因到基因产物会受到许多因素的影响，而改变最终产物。,分析DNA的多态性才能真正深刻地揭示 生物的多态性,第二节 DNA多态性的分类,一基因多态性 二重复序列多态性 三性染色体多态性 四线粒体的DNA多态性,一基因多态性,基因的多态性 遗传表型的多态性 在生物群体中，对于某一基因座位来说，属于这一位点的等位基因越多，这一座位的基因多态性就越复杂 。 HLA 白细胞抗原系统：仅HLA-DR抗原的编码位点就有HLA-DRA，-DRB1，B2，B3，B4，B5等10个座位，超过200个等位基因 。,二重复

6、序列多态性,串联重复序列 相同的核心序列（core sequence）按首尾相接的方式排列。,在重复序列两翼， DNA片段的碱基 组成相同,限制性内切酶,不同长度的 DNA片段,GATC,GATC,GATC,GATC,1,2,B,A,ssDNA探针,大片段 小片段,（1）不同个体核心序列重复的次数不同 （2）不同的串联重复序列，其核心序列的组成会不同 （3）在核心序列之间，有时不同的个体间会存在有无 插入小段的DNA序列或插入的片段长短不同之差,DNA指纹,由于不同的个体其核心序列重复的次数不同，应用限制性 内切酶酶切时，形成不同长度的DNA片段，这类多态性被称 为VNTR（variable

7、numbers of tandem repeats，VNTR）， 可变数串联重复序列多态性 。,两个无关个体之间的VNTR的变异能达到完全个体特异的程度,小卫星DNA（minisatellite DNA）:串联重复序列中有一类较短的，称为。许多基因的内含子部分含有此类序列。 特点：GC含量高 插入或缺失此类序列的事件发生频繁 ，有时还会发生跳跃复制的现象。 1985年，Jeffreys等 首先用人肌红蛋白基因内含子中一段高度重复的小卫星DNA为探针，获得了具有个体特异性的DNA指纹图谱。,中度重复的散在重复序列 ： 散在重复序列的某些重复单位可能是转座子（transposon）。 一种能够反复

8、插入到基因组中许多位点的特殊DNA片段。它可以从基因组上一个位点转移到另一个位点，从一个复制子转移到另一个复制子。,三性染色体多态性,X染色体着丝粒周围也有一类重复序列形成X染色体的VNTR类多态性。 Y染色体在哺乳动物的染色体中Y染色体似乎是最少保守性的。 用不同的限制性内切酶和DNA探针，可以揭示出Y染色体特异性片段的多态性。,四线粒体的DNA多态性,线粒体DNA属于核外基因，表现为非孟德尔规律遗传。 人mtDNA D环一端347bp的序列分析资料证明，两个无关个体间，这一段mtDNA序列完全相同的可能性只有0.27%（即1/370）。 因此，mtDNA序列组成的多态性同样可以用作个体识别

9、。,SNP单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP) 指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。 它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90%以上。 SNP在人类基因组中广泛存在，平均每5001000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。,第三节 DNA多态性分析技术,1979年，Jeffreys等人首先用限制性内切酶和-珠蛋白基因探针直接观察到DNA的多态性。即限制性片段长度多态性技术 。 1985年，Mullis等发明了聚合酶链反应（polymerase chain reaction，简称PCR）

10、技术 ，对DNA多态性的分析 。,一RFLP分析技术,（一）基本原理 限制性酶切片段长度多态性技术，简称RFLP技术（restriction fragment length polymorphism，RFLP）,1. 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease） 能够识别DNA双链上特异的碱基序列并能将之切断。不同的限制性内切酶有各自特异的识别序列，一般为48个碱基对 。 2. DNA区段碱基组成不同。用一种限制性内切酶消化，就会产生不同长度的酶切片段。,A 含1,2两个酶切位点的DNA片段 B 点突变使酶切位点1缺失 C 点突变产生酶切位点3 D 序列重排使酶切位点2

11、移位 E 含有酶切位点2的片段缺失 F 序列插入，如存在数量不同的串 联重复序列，即VNTR,1,2,1,2,2,3,1,2,1,1,2,采用合适的限制性内切酶 切出一系列长度的DNA片段 根据片段是否长度一致来推测其DNA序列是否相同 用标记好的相应的DNA探针与这些片段进行杂交 图谱反映出基因组DNA碱基序列组成是否存在差异。,RFLP通过核酸的限制性酶切片段长度多态性来揭示DNA碱基序列组成的不同，因而称为限制性酶切片段长度多态性技术。,（二）RFLP技术的基本步骤,抽提DNA（从血或组织） 培养细菌 人工合成探针 限制性内切酶消化 质粒纯化 纯化探针 琼脂糖凝胶电泳 标记探针（同位素或

12、非同位素） Southern转移、固定 预杂交 杂交 洗膜 放射自显影或显色后分析结果 RFLP技术的基本步骤,靶DNA的准备,核酸探针的标记,杂交显示,正常人染色体DNA含有4个完全一样的-珠蛋白基因，而-地中海贫血患者则缺失一个或数个-珠蛋白基因 用-珠蛋白基因探针对患者或产妇进行RFLP分析： 当用Eco RI 和Hpa I 酶切后，正常人标本出现4.8、4.1kb 两条杂交带；患者仅出现5.6 kb 杂交带 用Eco RI和Hind III 酶切后，正常出现2.1、3.1、16 kb 杂交带；患者出现2.1 、16 kb 杂交带。,遗传性疾病的基因诊断和产前诊断 -地中海贫血,5.6

13、kb 4.8 kb 4.1 kb,16 kb 3.1 kb 2.1 kb,（三）RFLP技术可选择的几个因素,1限制性内切酶 是影响RFLP图谱的一个重要因素。已分离500种 ，常见的100多种 识别序列：多数为4至6个碱基 识别4个碱基对的限制性内切酶能把人基因组DNA切出较短的小片段，而识别6个或更多碱基对的限制性内切酶，酶解出的较长的DNA片段。 如Sao3A I识别 GATC 如EcoR I位点为GAATTC 反应条件：包括反应液的pH，内含乙醇、甘油的量，反应温度和时间等，以及DNA的质量和浓度 。 星号*活性，即非特异性酶解活性,限制性核酸内切酶能够识别双链DNA分子中的某种特定核

14、苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。 识别位点：回文序列,反转重复序列，即旋转对称结构 一般为48个碱基对 例如 EcoRI 的识别序列： 5-GA A T T C-3 3-C T T A A G-5 BamHI 识别序列：,5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5,2核酸探针 由于人基因组DNA链很长，用某一限制性内切酶消化后，酶解出来的各种不同长度的片段往往数量巨大，电泳后几乎是连续排列的，无法进行分析比较。 选取某种特定的DNA片段作为探针，标上一定的标记物（如同位素、生物素等），利用碱基互补的两条DNA单链能结合（杂交）的原理，就可以在连续排列的一系列DNA片段中显示出与

15、探针有同源序列的某些DNA片段。 不同的DNA探针会显示出不同类型的 RFLP 图谱。,探针分类 ：,（1） 基因探针 大多数取自人基因组中某一基因的一个片段。 人类基因组中，最早确定有多态性的是珠蛋白基因位点和胰岛素基因位点。 cDNA探针 用mRNA反转录成cDNA，探测的是此基因中的外显子部分。 人工合成可以随研究者的设计而合成,（2）随机探针,随意挑选出的DNA片段 要能够揭示出人基因组DNA的酶切片段长度多态性就行。 特点：能比较快地了解该染色体的某些限制性片段多态性与研究对象（如某种疾病基因）的相关性。 片段较大的随机DNA探针比片段较小的更易检测出RFLP来,（3）重复序列探针

16、如小卫星DNA，其重复单位群集在基因组的某一特定区域。 重复序列探针能检测出基因组中多处具有此类重复序列的DNA片段。 特点：能一次性检测出多个位点的DNA片段多态性,Jeffreys等从第22号染色体上肌红蛋白基因的内含子中分离出来的高度可变的“小卫星DNA”探针。 并证明两个无关个体之间，这类多态性相同的机会极微（只有31011），因而他称这种RFLP图谱为DNA“指纹”。 应用：,亲子鉴定 法医学个人认定 人类学研究 遗传病相关性分析,人的DNA指纹分析示意图 子女DNA指纹图中分别与其父、母的DNA指纹中 相应的分子杂交条带相对应,（4）人工合成的寡核苷酸探针 1986年，Ali等以

17、Alu I 和 Mbo I 酶消化人基因组DNA后，用人工合成的（GATA）的寡核苷酸作探针进行检测，发现其RFLP图谱同样具有个体特异性。 这类探针检测的对象主要是人基因组中的散在重复序列DNA。 提示：根据自己研究的主要对象来设计各种各样的探针（包括各种长度的以及各种碱基组成的）。人基因组DNA用合适的探针和限制性内切酶酶切，一般都能揭示出人基因组中的RFLP。,1. 检测对象的DNA分子必须保持大分子。在抽提DNA过程中避免人为地将DNA分子机械性切割成小片段的DNA，否则最终的结果可能是一种假象。 2. 在用限制性内切酶消化大分子DNA时，要使DNA被完全消化，否则也会出假结果。 3.

18、 被消化的DNA浓度不能太高。 4. 电泳时要低电压电泳。 5. 杂交前探针必须充分变性。 6. 要根据探针标记的情况以及探针与靶DNA间序列互补的程度和GC含量来掌握洗膜的条件。 7. 作放射自显影时，要根据探针标记的放射比活性以及靶DNA的量等因素决定曝光的时间。,注意,二PCR分析DNA多态性,PCR（polymerase chain reaction）是一种在试管里扩增特定的DNA片段的技术。 设计引物：按照所研究的DNA（称靶DNA）片段的特点，设计出与此DNA片段二翼的DNA序列互补的寡核苷酸。 变性：通过加热（9295）使靶DNA（又称DNA模板）变性成为两条单链DNA。 退火（

19、复性）：然后将温度降至3755，引物就会结合在模板DNA中与其碱基互补的序列上。 延伸：将温度升至7072，在Taq DNA聚合酶的作用下，引物就会按53的方向，严格按照碱基互补的原则，逐步延伸。,1分析基因多态性,方法： 特异性引物 扩增 特异性基因片段 与此位点上所有的 等位基因探针都杂交 确定属哪个等位基因,等位基因间的差异一般表现为几个碱基或十几个碱基组成的不同，因而区分这些不同的等位基因多采用等位基因特异性探针（allele-specific oligonucleotide probe，ASO）与扩增出来的DNA片段进行杂交，根据能与哪一个探针进行杂交来确定该DNA片段属哪一个等位基

20、因。 人类HLA系统已知有30多个位点，超过500个等位基因。其中的某一位点，往往有多个、甚至几十个等位基因。,难以实现 多态性的分析,2分析扩增DNA的限制性片段长度多态性,扩增DNA的限制性酶切片段长度多态性（Amplification restriction fragment length polymorphism ,简称Am - RFLP）技术 概括为：PCR+酶切 应用举例：串联重复序列的核心很短（只有45bp），重复次数的差异又不大时，其扩增产物的长短较为接近，用普通琼脂糖凝胶电泳难以区分开来。 这时可以根据扩增片段碱基组成的规律，选择某种限制性内切酶对扩增片段酶切。这种酶切片段的

21、长度差异往往较大，可以用琼脂糖凝胶电泳区分出不同的等位基因。,载脂蛋白E（apoE）基因多态性与心脑血管疾病和老年痴呆密切相关，确定个体apoE基因对临床应用研究及诊断治疗十分必要。ApoE三种常见的等位基因是2、3、4，对目的基因进行PCR扩增后，以Cfo I 内切酶消化，结果： 一般在扩增的片段较长时常用此方法。 较为简便，无需测序和杂交，适于大范围人口检测和临床实验室开展。也称为PCR-RFLP。,3. 随机引物PCR法分析DNA的多态性 随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD),1990年，Willian 和Weles等创建 方

22、法：由于DNA组成完全是个体特异的，随意设计单个很短的引物去扩增不同人的DNA模板 结果：扩增出来的DNA片段的数量和大小会因人而异，通过电泳可以把不同个体的DNA扩增产物区分开来。,引物：长10个碱基左右，G和C的含量在5080%之间，不含回文结构，而且单条引物即可。 特点：可以在完全不知道特定DNA顺序的情况下分析其多态性，方法简便，能检出的遗传信息量大。,西红花及其伪冒品的RAPD指纹图 1.Marker 2.西班牙红花 3.印度红花 4.川红花 5.莲须 6.玉米须 7.黄花菜,不同来源同种药材的RAPD指纹图 1.新鲜西洋参 2.干品西洋参 3.西洋参组织培养物 4.新鲜人参 5.生

23、晒参1（干品） 6.生晒参2（干品）,应用：不仅可用于个人识别、疾病的相关性分析，还可用于其它各种遗传学研究（中药鉴定）。 优点： 可以用一系列的通用引物分析不同种类的生物。 可用于制备探针和分析未知的DNA顺序。 由于每一个RAPD标记对应一种DNA顺序，可大大简化多种相关研究。（通过随意引物扩增的DNA顺序，称为RAPD标记 ）,4.简单重复序列间区（inter-simple sequence repeats, ISSR） 简单重复序列（simple sequence repeats，SSR）又叫微卫星序列（microsatellite）：主要是以l4个核苷酸为基本单位的串联重复序列 其长度大多在100200bp 散在于基因组的不同位置 SSR进化变异速度快，因而，含有SSR的区域蕴涵了