目的基因的获取.ppt

1、目的基因的获取,1、什么是目的基因 2、目的基因获取途径 3、PCR法制备方法及过程,一、什么是目的基因 目的基因：是指基因工程操作中需要的外源基因，它是编码某种蛋白质的结构基因， 如生物的抗逆性基因、抗虫基因等。 从目的基因的概念来看， 最原始的目的基因是指从某甲种生物体内直接获得， 然后转入已知的某乙种生物体内并让其成功表达以使乙种生物能表现甲种生物的某种特征的基因。,需要克隆的DNA片段,编码某种蛋白质,研究某基因结构和功能的关系,研究某基因与疾病的关系,二、目的基因的获取,化学合成法,基因组DNA文库;cDNA文库,聚合酶链式反应,直接从染色体DNA中分离,三、PCR扩增获得目的基因,

2、1、PCR的含义,聚合酶链式反应 Polymease Chain Reaction(PCR) 是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。,PCR 可以把 指定的基因片段 几何放大,染色体,PCR 基因放大连琐反应,2、PCR的基本原理,试管中进行的DNA复制反应，依据 DNA半保留复制的机理； 体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性质； 通过人为控制体外合成系统的温度，使 双链DNA变成单链，单链DNA与人工合成的引物退火， DNA聚合酶使引物沿着单链模板延

3、伸为双链DNA。,3、PCR的反应过程,1）、预变性：使模板DNA的二级结构充分打开，让DNA双链充分解离,为了第一次退火过程时候引物可以尽量多的结合到模板上面。 一般的PCR反应的预变性温度是94或95，预变性时间一般设为3-5 min。,2）、变性：使DNA双链解离变为单链。一般9495，1min足以使模板变性 若低于94则需延长时间 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。,3)、退火(复性)：使引物结合在模板上。退火温度是影响PCR特异性的重要因素。 退火温度，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度，一般在40-65 之间。 对于20个核苷酸，G+C含量约50%

4、的引物，55作为选择最适退火温度的起点较为理想。,引物的复性温度的计算公式,Tm（解链温度）4(G+C)+2(A+T) 复性温度=Tm值（510）； 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性； 复性时间一般为3060s，足以使引物与模板之间完全结合。,4）、延伸：在DNA聚合酶的催化下，按照碱基互补配对原则不断合成DNA片段。延伸温度：一般选择在7075之间 常用温度为72 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） 34kb的靶序列需34min 扩增1

5、0kb需延伸至15min 延伸时间过长会导致非特异性扩增 对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些,4、PCR的反应过程演示,5、PCR法克隆基因的技术流程,设计引物 提取基因组DNA 进行电泳检测,进行PCR反应,5.1 设计引物,引物设计的原则： （1）序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。 （2）引物长度以15-40 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。 （4）引物内部避免形成二级结构。 （5）两引物间避免有互补序列。,（6）引物 3端的碱基要求严格配对（不能做任何修饰）， 5端无严格限制。 （7）引物5端可修饰 引物5端限定着PCR产物的长度，但对扩增特异性影

6、响不大；引物5端碱基可不与模板DNA互补而呈游离状态；引物5端最多可加10个碱基而对PCR反应无影响。,限制性内切酶的识别序列 启动子序列 定点突变 探针标记,3,5,3,5,5.2 提取基因组DNA,模板DNA的来源： 微生物中提取DNA 植物中提取DNA 从细胞中提取DNA：血细胞、绒毛、尿样、毛发、精斑、口腔上皮细胞 固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K消化 模板DNA的浓度： 0.12ug/100ul体系 PCR产量随模板DNA浓度的增加而显著升高 模板DNA浓度过高导致非特异性产物增加,5、3 进行PCR反应,5、4 PCR反应体系与流程,反应体系 模板（DNA或RNA） 引物 Taq DNA聚合酶 10PCR缓冲液 1.54 mM Mg2+ 0.2 mM dNT