MTT法小结.ppt

1、MTT法显示细胞活力、在特定细胞数范围内，MTT晶体的形成量与活细胞数成正比。活细胞MTT，丁二酸脱氢酶，紫色蓝色结晶Formazan，壁细胞操作程序，1。接种细胞：用0.08%的胰岛蛋白质消化单层培养细胞，用单细胞显液配制含血清的培养液，每孔5000 6000个细胞接种到96孔。(边缘孔中填充了空徽章。)2 .细胞培养：将培养板转移到CO2孵化器，在37，5% CO2和饱和湿度条件下培养，细胞单层复盖在孔底(96公平板)，添加浓度梯度的药。原则上，如果细胞贴在墙上，就可以添加药物，如果每个孔放入约50 ul，通常就会安装3个腹腔。3.5%CO2，37孵化20小时用倒置显微镜观察。4 .每个孔

2、放入10ul MTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，继续培养4h。如果药物和MTT能反应，就扔掉离心后培养液，用PBS冲洗2 3次，加入含有MTT的培养液。5.停止培养，小心地吸出孔内培养液。6.每个孔添加100ul二甲基亚砜，摇晃床低速10min振动，晶体完全溶解。在酶联免疫检测器OD490nm中测定每个孔的吸光值。7.设置零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，同时设置孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)，悬浮细胞操作程序：1)细胞悬液浓度调节1106/ml actinomyy检验品10ul需要牙齿。细胞显液50ul(即5104cell/孔)，总计100ul牙

3、齿96孔口板块(角孔用无菌水填充)中添加。每一版设定对照。2) 37，5% CO2孵化16-48小时，倒置显微镜下观察。3)每孔加入10 ul MTT溶液(5 mg/ml，即0.5%MTT)，继续培养4 h。(建议对悬浮细胞进行WST-1，培养4 h直接测定)，直接酶联免疫吸附检测器OD570nm(630nm校准)测定每个孔的吸光值)4)离心(1000-x10min)，小心吸入，每个孔增加100 ul二甲基亚砜5)同时设置零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)，每组设置3个孔。药物准备、浓度体积过滤、MTT的赵霁、MTT一般目前效

4、果最好。过滤后4C被光保留在两周内有效，或制成5mg/ml，器官保留-20度。特别是当MTT变为灰色绿色时，绝对不能再使用。MTT有致癌性，使用时要小心，最好带上那种透明的副膜手套。调配的MTT需要无菌，MTT对细菌敏感。96孔板加时间，不避光也没关系。因为时间短。准备MTT时，也有人用PBS溶解，生理盐水配方，60水浴溶解。实验结果统计学处理，所有数值显示为xs，SPSS软件应用方差分析，P0.05差异很大，P0.01差异很大。时间可以横轴，光吸收值可以纵轴绘制细胞线，特殊公式求出反水抑制浓度(IC50)。或计算抑制率。OD控制组-OD实验组细胞死亡率%=OD控制组，100%，注意事项，1选

5、择适当的细胞接种浓度。在进行MTT实验之前，必须测量每个细胞的附着率、倍增时间及徐璐不同接种细胞数条件下的生长曲线，然后确定实验中每个孔的接种细胞数和培养时间。设置2空对照，与实验并行，设置只添加培养液的空对照孔，不添加细胞。最后比较颜色时，用空孔调节0。实验前要明确的问题，1。选择适当的细胞接种浓度。一般来说，96孔培养板的内壁细胞填满时，会生长约105个细胞。但是，细胞贴在墙上后的面积有很大的不同，所以在进行MTT实验之前，要先进行实验，测试壁率、扩增时间、接种细胞数的生长曲线，确定实验中每个孔的接种细胞数和培养时间，使培养结束。只有这样，MTT晶体才能形成参爵量和细胞数所表示的线性关系。

6、否则细胞数过多，敏感性下降，太少，观察不到差异。2 .设定药物浓度。必须多看文献，参考别人的结果，确定更大的范围，先体质。根据自己的超导体结果，减少浓度和时间范围，再仔细筛选。记住！否则，你使用的时间和浓度可能不是药的有效浓度和时间。3.时间点设置。输入不同时间点的测量OD值，excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化，绘制变化的曲线，当曲线变平(成为平台周期)时，该时间点应该是最佳时间点。(因为这时细胞增殖的抑制作用最明显。)，4 .训练时间。200ul的培养液对10的45平方的增殖期细胞很难维持68h。营养不足的话，细胞会从增殖机逐渐倾斜到G0机停止，影响结果。我们在48h改变液体。5.

7、MTT方法只能测量细胞相对数量和相对活力，不能测量细胞节水。做MTT的时候，细菌也会引起MTT非颜色OD价值上升，所以尽量进行无菌操作。7 .实验时应设置零孔、对照组孔、加药孔。零孔加徽章，MTT，二甲基亚砜。对照组和加药工人都要在细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜、对照组孔中添加溶解剂的介质，加药组要添加浓度不同的药物。8.避免血清干扰。15用胎牛血清培养液培养细胞时，高血清物质对实验孔光吸收值的影响。实验的基础增加了，将测试敏感性。因此，一般选择小于10胎牛血清的培养液进行。上色后，尽可能吸出培养孔内的剩馀培养液。至于细胞接种(板)，细胞30岁以后就不用了。培养板是好的(最好的进口板)，不好

8、的板或重复使用的板只能做试验。接种时，根据字典实验中摸索的密度接种，细胞太密或太少，增殖过快或太慢，增值率线性关系不好。因此，MTT细胞密度经常使用10000/ml，100ul/孔。细胞密度取决于其他细胞的特性。悬浮细胞每孔细胞数可达105个，壁细胞可达103-104个。MTT本身是比较粗的实验，增殖率在10%左右的波也不奇怪。尤其是初学者，20的波也很常见，因此很可能是技术原因。特别是终板技术必须通过。细胞显液必须均匀混合，避免细胞已经沉淀，每个孔的细胞数不一样，每几个可以再混合一次。取样器操作要熟练，尽量避免人为误差。另外，分散的次数过多也会影响细胞活力。所以要精通鞋子，要快上盘。青青去除

9、方法，直接吸入：在添加DMSO之前，必须吸液体，但培养液中的紫色结晶可以吸出，但在此之前，平面离心机原裁判96板块，2000r，5分钟，以及青青(如果是悬浮细胞，建议使用牙齿方法，悬浮细胞的离心力为2500rpm10min翻转法：可以翻转板23次，比“吸”法更不易取出细胞。可以轻轻拍打，倾斜可以帮助吸入液，但是细胞必须很好地附着在墙上。加入DMSO。建议不要在同一实验中更换DMSO。添加DMSO之前，请尽可能干净地扔掉孔中的液体。如果培养液不干净，空孔内也应该留有等量的培养液。这样可以最大限度地消除检查时培养液的影响。DMSO的转让也可以牙齿为100ul或150ul。添加DMSO后，用振荡器轻轻振动510min，时间控制尽可能严格，放置时间长会影响结果，OD价值测量，波长测量选择取决于发色溶液。DMSO的溶解后为紫色(红色)，具有490nm牙齿最大吸收值。DMSO融化后10分钟内测量，颜色更深，用溶解液吸收光的值可以维持3天。细胞密度大，测量的吸光度也大，细胞密度小，吸光度也小。也与细胞状态有关，如果细胞状态不好，吸光度也会降低。细胞数量少或培养时间短的话，ODP也会降低。每个孔之间的差异特别明显会有污染，空孔的ODM值太高，很可能是细菌污染。材质，(a)装置1。净化工作台2。