绿色荧光蛋白PPT参考课件.ppt

1、绿色荧光蛋白将颜色引入生命科学研究，绿色荧光蛋白为生命科学研究带来颜色，张超，南京师范大学生命科学学院，2011年11月9日，1，绿色荧光蛋白的分子生物学与应用，2，2008年诺贝尔化学奖，绿色荧光蛋白的发现与发展，马丁查尔菲下村大村，美国马萨诸塞州伍兹霍尔海洋生物实验室钱永健；美国马萨诸塞州波士顿大学医学院、美国纽约州纽约市哥伦比亚大学、美国加利福尼亚州圣地亚哥加州大学；霍华德休斯医学研究所，3岁，2008年诺贝尔化学奖获得者和他的贡献，在日本下村学习，从名古屋大学毕业后去了美国，并在普林斯顿大学、波士顿大学和伍兹霍尔海洋生物实验室工作。1962年，荧光蛋白从水母中被发现，被认为是第一个研究

2、生物发光的人。钱永健，美籍华人，现为加州大学圣地亚哥分校生物化学和化学教授，美国国家科学院和美国国家医学院院士，2004年获沃尔夫医学奖。他的主要贡献是利用水母的绿色化学物质在实验室中追踪生物反应，他被认为是这一领域的先驱。马丁查菲(Martin Charfe)，美国哥伦比亚大学生物学教授，他的主要贡献是向人们展示了绿色荧光蛋白作为一种发光基因标签的功能，这种标签在生理学和医学中有着广泛的应用。1962年，Shimomure等人首次从维多利亚水母中分离出绿色荧光蛋白。绿色荧光蛋白的研究历史，维多利亚水母(Aequorea Victoria)，5，一个试管，内含一种来自海葵的青色(绿蓝色)荧光蛋

3、白样品，由下面的紫外光照射。水母中的一种发光蛋白质，当它与钙离子结合时会发出蓝光，这种蓝光会立即被蛋白质吸收，从而发出绿色荧光。捕捉蓝光并发出绿光的蛋白质是绿色荧光蛋白7，而水母发光蛋白发出的蓝光通过能量转移刺激绿色荧光蛋白发出绿光。水母发光蛋白去辅助水母发光蛋白氧化荧光素蓝光绿色荧光蛋白绿色水母发光蛋白在钙离子的刺激下发光，其能量可以转移到绿色荧光蛋白上，刺激绿色荧光蛋白发光。这是物理化学中已知的生物学中荧光共振能量转移(FRET)的发现。钙离子，蓝光，发光过程，8，大村秀，大村秀成为第一个从水母中分离绿色荧光蛋白的科学家，并发现该蛋白在紫外光下呈亮绿色。他被认为是生物发光研究的第一人。19

4、92年，普拉舍克隆了绿色荧光蛋白基因的cDNA，并分析了绿色荧光蛋白的一级结构。马丁查菲，如果说大村是绿色荧光蛋白的助产士，那么查菲就是绿色荧光蛋白价值的发现者。马丁查菲等人为绿色荧光蛋白基因表达的实现做出了突出贡献。他对该奖项的主要贡献是向人们展示绿色荧光蛋白作为发光基因标签的作用。11，绿色荧光蛋白的研究历史。1994年，查尔菲等人首次在大肠杆菌细胞和线虫中表达绿色荧光蛋白，开创了绿色荧光蛋白的应用。钱永健和钱永健在绿色荧光蛋白转化方面取得了突出成就。1995年，他的单点突变(S65T)显著改善了绿色荧光蛋白的光谱特性、荧光强度和光稳定性。钱永健的主要贡献在于利用绿色荧光蛋白跟踪各种生物细

5、胞的生物反应，他被公认为这一领域的先驱。13，之后人们发现绿色荧光蛋白可以在多种异源细胞中表达，这引起了细胞学、分子生物学、医学、病毒学等领域的迅速兴起。1997年10月18日至22日在美国新泽西举行了一次绿色和平国际会议。2007年1月7日，东北农业大学刘中华教授成功主持了转基因克隆猪项目。中国首例绿色荧光蛋白转基因克隆猪成功产下2头具有绿色荧光基因特征的仔猪。这是继美国、韩国和日本之后，通过体细胞核移植成功生产绿色荧光蛋白转基因克隆猪的第四个案例。绿色荧光蛋白的研究历史，15，绿色荧光蛋白的结构分析，16，绿色荧光蛋白的结构分析，维多利亚水母绿色荧光蛋白的全长cDNA编码区为717nt，1

6、7，绿色荧光蛋白的结构分析，由238个氨基酸组成，分子量约为27 KD。绿色荧光蛋白晶体结构显示，蛋白质的中心是一个长420纳米、宽240纳米的盆状结构，由11个围绕中心螺旋的反平行折叠组成。荧光基团的形成从这个螺旋开始。罐子的顶部被三个短的垂直部分覆盖，而底部被一个短的垂直部分覆盖。对荧光活性非常重要的发色团位于一个大空腔中。19，绿色荧光蛋白的结构分析，绿色荧光蛋白折叠模式的拓扑图。片状股显示为淡绿色，螺旋显示为蓝色，连接环显示为黄色。还给出了序列中每个主要二级结构元素的起始和结束位置。反平行股(除了股1和股6之间的相互作用)形成一个紧密形成的桶。绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白由238个氨基酸组

7、成，以长链连接在一起。这条链子可以折叠成啤酒罐的形状。在啤酒罐内部，氨基酸65、66和67构成了吸收紫外线和蓝光并发出绿色荧光的化学基团。绿色荧光蛋白的锅状结构，绿色荧光蛋白的结构分析，二聚体接触区。两条多肽链结合在一个广阔的区域上，有一个小的疏水贴片(在黄色方框中)和许多亲水触点。双对称轴在页面平面内，用红色箭头标记。极性树脂用红色原子表示氧，蓝色原子表示氮。绿色荧光蛋白的结构分析，22，绿色荧光蛋白的发光特性，绿色荧光蛋白的吸收光谱，最大峰值在395纳米(紫外)，第二峰值在470纳米(蓝光)；发射光谱的最大峰值在509纳米(绿光)，最大峰值在540纳米。绿色荧光蛋白的发光特性以及绿色荧光蛋

8、白的光谱特性与异硫氰酸荧光素(FITC)非常相似，因此为荧光素FITC设计的荧光显微镜滤光片组合也适用于绿色荧光蛋白的观察。虽然450-490 nm(蓝光)是绿色荧光蛋白的二级吸收峰，但由于其长波能量低和细胞耐受性强，更适合于体内检测。绿色荧光蛋白的荧光非常稳定，在激发光下，尤其是在450-490纳米的蓝光波长下，其耐光漂白性强于荧光素。24、GFP需要在氧化态产生荧光。强还原剂可以将绿色荧光蛋白转化为非荧光形式，但一旦再次暴露在空气或氧气中，绿色荧光蛋白的荧光将立即恢复。然而，一些弱还原剂不影响绿色荧光蛋白的荧光。中等氧化剂对绿色荧光蛋白的荧光影响不大，如生物材料的固定化、脱水剂戊二酸或甲醛

9、等。然而，绿色荧光蛋白对一些密封指甲油特别敏感。绿色荧光蛋白的荧光在pH7.0-12.0时稳定，在pH5.5-7.0时受影响。在高温(70)、极端酸碱度或氯化胍条件下，绿色荧光蛋白会变性并消失，一旦外界条件恢复正常，荧光会部分恢复。绿色荧光蛋白25的发光特性绿色荧光蛋白发色团的骨架在左边。蛋白质链形成一个圆柱形的罐子(蓝色)，部分子链直接穿过中间(绿色)，发色团正好在罐子的中间，不受周围环境的影响。这种保护对于荧光的发射是必要的。一旦发色团吸收了光子，活化的水分子通常会带走它的能量。然而，蛋白质通过发射能量较低的光子来释放能量而得到保护。发色团(右)由蛋白质链中的三种氨基酸自发形成：甘氨酸、酪

10、氨酸和苏氨酸(或丝氨酸)。绿色荧光蛋白的发光基团绿色荧光蛋白荧光主要归因于分子中第65、66和67位的丝氨酸、酪氨酸和甘氨酸形成的发色团。，27，GFP荧光发色团，在翻译的蛋白质折叠和环化后，在O2的存在下，分子中Gly 67的酰胺攻击Ser 65的羧基形成第五个碳原子的咪唑基团，并且在Tyr 66的2键的脱氢反应后，芳族基团与咪唑基团结合。通过这种方式，对羟基苯甲酸咪唑环酮的发色团在绿色荧光蛋白分子中形成，并且该过程可以被自动催化。绿色荧光蛋白的发光基团，28，荧光团及其环境的立体图，his148，Gln94和Arg96可以在荧光团的相对两端看到，并可能稳定荧光团的共振形式。带电、极性和非极

11、性侧链都以某种方式接触荧光团。绿色荧光蛋白的发光基团，Gln94，Arg96，29，荧光团及其环境的模型以2.2的分辨率叠加在MAD相态电子密度图上。整个m ap的清晰定义允许链条被追踪，侧链被放置好。Ser65、Tyr66和Gly67的密度与为荧光团提出的脱氢酪氨酸-咪唑啉酮结构非常一致。邻近荧光的许多侧链被标记。绿色荧光蛋白30的发光基团绿色荧光蛋白的荧光机理尚不清楚。Morise等人提出了一种能量转移模式来解释水母的发光机制，但没有被认识到。Chattoaj等人分析了绿色荧光蛋白的光谱，并结合前人的工作，提出绿色荧光蛋白有两个明显的吸收带，分别对应绿色荧光蛋白的基态A和基态B，具有两种不

12、同的构象。基态A对应于395纳米处的吸收峰，基态B对应于475纳米处的吸收峰，这是主要的。基态B的分子数约为基态A的1/6，两个基态可以缓慢转变，但激发态(*)迅速转变，发生质子转移。目前，绿色荧光蛋白的作用机制只有一种认识：绿色荧光蛋白是生物发光过程中的能量受体，是最终的发光体，不同的生物发光机制不同，不同的突变体发光机制也有很大差异。在体外，绿色荧光蛋白对高温(70OC)、碱性、去污剂、盐、有机溶剂和大多数常见的酶(除了链霉蛋白酶)有很强的抗性。绿色荧光蛋白融合蛋白的荧光灵敏度远高于荧光素标记的荧光抗体，且其抗光漂白能力较强，更适合定量测定和分析。然而，由于绿色荧光蛋白不是一种酶，荧光信号没有酶促放大作用，绿色荧光蛋白的灵敏度可能低于一些酶报告蛋白。由于绿色荧光蛋白荧光是生物细胞的一种自主功能，并且荧光的产生不需要外源反应底物，绿色荧光蛋白作为一种广泛使用的活的报道蛋白，具有任何其他酶报道蛋白无法比拟的功能。绿色荧光蛋白的其他生化特性，绿色荧光蛋白作为标记蛋白的优点，荧光稳定，检测方便，无物种特异性，不受细胞类型和33位的限制，绿色荧光蛋白对受体细胞基本无毒，易于构建载体，无假阳性干扰，无任何反应底物和辅助因子，可制成永久性