疫苗中支原体的检测.ppt

1、疫苗中麦科等离子体的检测，11级生苗药友地图教师：张丽娇，主要内容，1。迈可等离子体2。迈可等离子体损失3。迈可等离子体检测方法，培养法，指令细胞培养方法，1。支原体，又名真菌体，是目前发现中最小最简单的原核生物。结构也比较简单。因为大部分是球形，没有细胞壁，只有三层结构的细胞膜，所以可变性很大。那个大小介于细菌和病毒之间。通过过滤器，细胞培养工作及发酵和制药灭菌会产生污染问题。一般来说，葡萄糖或精氨酸可以用作主要碳源。2 .支原体的危险，致病性支原体一般包括肺炎支原体、肺炎支原体和生殖器支原体。肺炎支原体引起支原体肺炎，又称原发性非典型肺炎，支原体肺炎常年爆发，冬天见多，但可能有小流行。玩偶

2、支原体和生殖器官支原体通常引起尿道及生殖器感染。3.1培养法，建议培养基和处方，(1)支原体肉汤培养器猪胃消化液500毫升氯化钠2.5g牛肉浸液(133602)500毫升葡萄糖5.0g酵母浸液5.0g酚红0.02g pH值7.60.2 121灭菌15分钟。(2)精氨酸麦考等离子体肉汤培养基猪胃消化液500毫升牛肉浸液(1:2)500毫升葡萄糖1.0g酵母唾液5.0g L-精氨酸2.0g酚红0.02g氯化钠2.5g pH值7.10.2。121灭菌15分钟。(3)迈可等离子体半流体培养基按(1)项的处方配制，培养基中不加酚红，加入琼脂2.53.0g。(4)迈可等离子体琼脂培养基按(1)项的处方配制

3、，培养基中不加酚红，加入琼脂13.015.0g。培养基灵敏度检测，(1)菌种肺炎支原体(ATC15531)，口腔支原体(ATC23714)由国家药品检验机构分发。(2)操作将菌种接种到适当的支原体培养器，从361培养到培养器变色，经过2台盲前，将培养物接种到检查大气培养器，稀释10倍系列，将肺炎支原体稀释10-710-9，接种到支原体培养器。口腔支原体稀释为10-310-5，接种于精氨酸支原体培养器。稀释度糖试管3个，36丝1培养7，14天观察培养基变色结果。(3)结果判定接种后培养基管数超过2/3的变色最大稀释度为相应培养基的灵敏度。液体培养基的敏感度：肺炎支原体(ATC15531)应达到1

4、0-8，口腔支原体(ATC23714)应达到10-4。检查培养基处理，支原体半流体培养基和支原体肉汤培养基(或支原体琼脂培养基)。支原体半液体培养基(或琼脂培养基)在使用前煮沸10 15分钟，冷却56左右，然后加入人去除新生牛血清(培养基对血清体积比833602)，加入适量的青霉素，充分摇晃。液体培养基除了不需要沸腾外，使用前也要补充相同的成分。接种培养，分别培养10毫升的麦科等离子体半液体培养苗(冷到36丝1)和4个麦科等离子肉汤培养机，各培养基接种试验品0.5 1.0毫升，36丝1培养21天。接种后第7天，取4个中的2个进行二次培养，每1个培养基中有2个支原体半液体培养器及支原体肉汤培养器

5、，每36个L培养21天，每3天观察1次，结果显示，在培养结束时，接种供应品培养器中均没有支原体生长，提供试用品被判定为合格。如果怀疑支原体生长，可将试用品再测试增加一倍。例如，如果没有支原体生长，检测品被判定为合格，如果还存在支原体生长，检测品被判定为不合格。3.2标记细胞培养方法(DNA染色法)，准备实验试剂，(1)二苯甲酰胺荧光染料浓缩液为二苯甲酰胺荧光染料5毫克，外加100毫升酚红和碳酸氢钠Hank s平衡盐溶液，室温下用磁搅拌器搅拌3040分钟。完全溶解，-20被光保存(2)在二苯甲酰胺荧光染料工作液酚红和碳酸氢钠汉克斯溶液100毫升中加入人二苯甲酰胺荧光染料浓缩液lml搅拌。(3)固

6、定液乙酸：甲(体积比1:3)混合液。(4)封液量为0.1毫升/L柠檬酸溶液22.2毫升，0.2毫升/L磷酸氢钠溶液27.8毫升，甘油50.0毫升，将pH值调节为5.5。培养基及指示细胞处理，(1) DMEM完全培养基。(2)没有DMEM抗生素徽章。(3)指示细胞(无支原体污染的Vero细胞或其他传代细胞)消化培养的Vero细胞后，每lml制造105个细胞显液，每孔0.5ml接种到6孔细胞培养板或其他容器，每孔添加3ml抗生素培养基，在36公司1、5二氧化碳条件下进行通宵培养。为进行试用品处理，(1)细胞培养物质通过无抗生素培养液传递到至少一台，细胞满了，3天没有交换的细胞培养上清液，等待检查。

7、(2)毒瘤显液(如牙齿毒瘤)表明细胞会形成病变，影响结果判定时，应用对支原体没有抑制作用的特异性抗血清和病毒后或不会引起细胞病变的另一指示细胞。(3)其他检测品检查时选择的指示细胞必须是牙齿供应品不影响生长的细胞。指示细胞培养后用固定棒准备的指示细胞培养板中放入供应品(细胞培养上清液)2毫升(毒瘤或其他供应品最低lml)，在36公司1，5%二氧化碳条件下培养35天。至少一次，指示最后一次传代培养，用包括盖子幻灯片在内的6孔培养板培养35天，从培养孔中吸出培养液，加入5毫升人固定液，5分钟吸出固定液，5毫升固定液，吸出固定液10分钟，在空气中干燥，放入苯甲酰胺荧光染料附加室温30分钟左右，吸出染色液。用荧光显微镜观察。用阴性、阳性对照处理、无抗生素培养基2毫升替换原型，用同样的方法操作，用被称为女性对照组的阳性-供品标准菌株2毫升替换原型，用同样的方法操作，用作阳性对照。结果判定，(1)阴性控制：只有表示细胞的细胞核呈黄绿色荧光。(2)两性控