实验一 动物细胞蛋白质的提取和含量测定.ppt

1、实验一 动物细胞蛋白质的提取和含量测定,主要内容,一、概述 二、实验目的 三、实验内容 四、实验原理 五、试剂与器材 六、操作步骤,一、概述,蛋白质的定量分析是生物化学和其他生命学科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多生物制品，药物、食品质量检测的重要指标。在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，则是经常进行的一项非常重要的工作。,二、实验目的,1、掌握从动物样品中提取细胞蛋白质的基本方法。 2、掌握几种常用的蛋白质定性定量的方法并了解其各自的特点。,三、实验内容,（一）小鼠肝脏细胞蛋白质的提取 （二）三种蛋白质含量测定方法,四、实验原理,（一）

2、小鼠肝脏细胞蛋白质的提取 1. 一般动物细胞膜比较脆弱，易于破碎，本实验采用匀浆法破碎细胞，高速离心法弃去细胞碎片。 2、选择适当的提取液是蛋白质提取的关键，提取液的pH通常根据蛋白的等电点来确定，要偏离等电点。选择合适的离子强度的盐溶液促溶蛋白质，若强度过高，可能造成蛋白质的盐析。,3、稳定蛋白质的性质 （1）防止目的蛋白变性：缩短提取时间，低温。 （2）防止蛋白质降解：防止蛋白酶对蛋白质的降解作用，肝脏组织中蛋白酶含量较高，更应注意。如胃蛋白酶抑制剂可抑制酸性蛋白酶，EDTA可抑制金属蛋白酶等。 （3）防止蛋白质巯基氧化：还原剂（如巯基乙醇、二硫苏糖醇等）。,4、初提液的浓缩（利于下一步分

3、离）：常用沉淀法，超滤法，冷冻干燥法等。适当的沉淀剂可浓缩样品，并可去除核酸。 沉淀法：蛋白溶液中加入有机溶剂（如丙酮、乙醚等），通过其脱水作用和减少溶剂的极性使蛋白沉淀。或者加入硫酸铵到一定浓度，蛋白可通过盐析作用沉淀。 5、沉淀分离的蛋白，可通过重新溶解，透析法和柱层析法脱盐脱有机溶剂。,目前测定蛋白质含量的方法有很多种，下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些蛋白质测定方法： 物理性质：紫外分光光度法。 化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry法等。 染色性质：考马斯亮蓝染色法、银染法。 其他性质：荧光法。,（二）蛋白含量测定,1、Lowry法（Folin酚试剂法） 2、Bradford法

4、 （考马斯亮蓝法） 3、紫外吸收法 这些方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这几种方法测定，有可能得出几种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏1020倍.在选择方法时应考虑：实验对测定所要求的灵敏度和精确度；蛋白质的性质；溶液中存在的干扰物质；测定所要花费的时间。,1、 Folin酚试剂法（Lowry法） （1） 原理： 在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。 Folin酚试剂中的磷钼酸盐磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定

5、的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。,（2）优点,1、灵敏度高。 2、不需复杂仪器,（3）缺点,1、需要顺序加入几种不同的反应试剂；反应需要的时间较长；操作要严格计时。 2、容易受到非蛋白物质的影响；含EDTA，Triton x-100，硫酸铵， Tris缓冲液，甘氨酸，各种硫醇等物质的蛋白不适合此种方法。,（4）注意事项,进行测定时，加Folin酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当Folin一酚试剂加入蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。,（1）原理： 考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水区相结

6、合，考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。,2、考马斯亮蓝法(Bradford法),（2）优点,1. 灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。2. 测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要515分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Low

7、ry法那样费时和严格地控制时间。,3. 干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。Tris，乙酸，2巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如Triton X100，SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。,（3）缺点,1. 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。 2. 仍有一些物质干扰此法的测定

8、，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。 3. 标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线。,（1）原理 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收 。是蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。,3、紫外吸收法,（2）优点,1、紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单，不消耗样品，测定后仍能回收使用。 2、低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为

9、此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。,（3 ）缺点,1、此法的缺点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。 2、若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。 3、此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH值，

10、测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。 4、敏感度低，要求蛋白的浓度较高。,五、试剂与器材,（一）小鼠肝脏细胞蛋白质的提取 试剂：样品提取缓冲液，蛋白酶抑制剂，生理盐水 器材：冷冻离心机，玻璃匀浆管，天平，移液管，移液枪，解剖剪刀 实验动物：小鼠,（二）三种蛋白质含量测定方法,试剂：试剂甲，Folin酚试剂乙，考马斯亮蓝G250染料试剂，0.5mg/ml的牛血清白蛋白贮液，2mg/ml的牛血清白蛋白贮液 器材：紫外分光光度计，可见光分光光度计，移液管,六、实验步骤,（一）小鼠肝脏细胞蛋白质的提取 1、处死小鼠取肝脏，放入冷的生理盐水漂洗干净。 2、取0.5g小鼠肝组织，滤纸上剪碎，放入

11、玻璃匀浆 管中。 3、1：15的比例往匀浆管中加入匀浆缓冲液（即每份样品需加预冷的提取缓冲液7.3ml，蛋白酶抑制剂0.2ml），手动匀浆，注意用力均匀，以免损坏匀浆管。 4、 1.5ml Eppendorf管两个各取1.2ml的匀浆液，置入冷冻离心机中4度13000rpm离心20min，小心移取上清液至离心管中，低温保存，作为待测样品备用。,（二） Lowry法测定蛋白质浓度,1.取16支大试管，1-6号试管内分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.5ml标准蛋白质溶液（浓度为0.5mg/ml）。用双蒸水补足到0.5ml，在7、8号试管内分别加入待测样品25、50l，并用双蒸水补足至0.5m

12、l。9-16号重复1-8号。 2. 然后每支试管加入2.5毫升试剂甲，立即摇匀，于室温放置10分钟（要严格计时）。 3.逐管加入0. 5毫升试剂乙（Folin酚试剂），同样立即充分混匀。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30-60分钟。,4.以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，将样品和待测品在可见分光光度计上于550nm处测定各管中溶液的吸光度值。 5.以已知含量的标准蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。 注意，由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色

13、的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。,1.取16支试管，1-6号试管内分别加入0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.1ml标准蛋白质溶液（浓度为0.5mg/ml）。用双蒸水补足到0.1ml，在7、8号试管内分别加入稀释20、10倍的待测样品0.1ml。9-16号重复1-8号。 2.然后每支试管加入考马斯亮蓝G250染料3ml，摇匀，于室温静置3分钟。 3.分光光度计于波长595nm比色。 4.以已知含量的标准蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。,（三） 考马斯亮蓝法测蛋白浓度,1.取16支试管，1-6号试管内分别加入0，0.3，0.45，0.6，0.75，0.9ml标准蛋白质溶液（浓度为2mg/ml）。用双蒸水补足到每管总体积3ml，在7、8号试管内分别加入稀释100、50倍的待测样品3ml。9-16号重复1-8号。 2.以1号管为参比，用紫外分光光度计于波长280nm处比色。 3.以已知含量的标准蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算