免疫沉淀技术.ppt

1、免疫沉淀技术,免疫沉淀技术,免疫沉淀反应定义 免疫化学基础 免疫沉淀技术分类 免疫沉淀技术的应用,免疫沉淀技术,免疫沉淀反应定义 免疫化学基础 免疫沉淀技术分类 免疫沉淀技术的应用,免疫沉淀反应,可溶性抗原与相应抗体在液相或凝胶中特异性结合后，形成的免疫复合物在一定条件下出现的蛋白质析出现象。 与凝集反应、中和反应、补体参与的抗原抗体反应并称经典免疫学技术,免疫沉淀技术,免疫沉淀反应定义 免疫化学基础 免疫沉淀技术分类 免疫沉淀技术的应用,沉淀反应原理,沉淀原（precipitinogen）,沉淀素 （precipitin）,抗原抗体间的力,疏水性的改变 电荷的改变 分子量及结构的改变,沉淀的

2、发生,抗原的价,抗体的价,IgG、IgA、IgD和IgE类抗体： 两价 分泌型IgA：四价 IgM类抗体：十价,亲和力和亲合力,affinity,avidity,抗原抗体反应的特异性,特异性的物质基础,epitope,交叉反应,交叉反应的物质基础,1. 抗原异质性 （antigen heterogeneity） 2. 共同抗原决定簇 （common antigenic determinant） 3. 决定簇相似,共同抗原的类型,1. 同种抗原 2. 嗜异性抗原（又称Forssman抗原）,肝 脾 肾上腺,制成细胞悬液,抗体,反应,反应,绵羊红细胞,与临床免疫性疾病发生 有关的异嗜性抗原 乙型溶

3、血性链球菌(A族)细胞壁与人肾小球基底膜、心瓣膜和心肌组织有共同抗原。 大肠杆菌O14的脂多糖与人结肠粘膜之间也存在共同抗原，它与溃疡性结肠炎的发生有密切关系。,抗原抗体反应的最适比例,抗原抗体反应的阶段性,抗原抗体结合阶段 2. 抗原抗体反应阶段,抗原抗体反应的影响因素,1中性盐的作用 2pH 3温度 4离子强度,中性盐的作用,加入高浓度盐（如硫酸铵）以脱水，或者用分子量大约6000，浓度34%聚乙二醇（PEG6000），以其多聚物孔隙排阻脱水来大大降低抗原抗体复合物的溶解度。,pH值,尽可能调节pH至复合物的等电点附近，通常此pH值是介于IgG等电点（约pH=7）和抗原等电点之间，也依赖于

4、抗原与抗体的比例。,温度,温度与抗原抗体反应有密切的关系 温度升高可促使分子运动加快，抗原与抗体碰撞机会多，容易结合，但也容易再解离; 温度低，分子运动慢，撞击机会少，但一旦结合后则不易再分开。,离子强度,（1）有利于抗原抗体结合的条件： 中等或较低离子强度 （2）有利于抗原抗体解离的条件： 高离子强度,免疫沉淀技术,免疫沉淀反应定义 免疫化学基础 免疫沉淀技术分类 免疫沉淀技术的应用,沉淀反应的种类,1溶液中沉淀反应 2凝胶中沉淀反应,溶液中沉淀反应,是指在清彻透明的液体中，呈溶解状态的抗原与抗体在试管内或凹玻片上混匀，可凝聚成为肉眼可见的絮状或颗粒状的不溶性沉淀物。,絮状沉淀试验,康氏反应

5、（Kahns test）: 心肌提取的类脂质抗原+反应素（Aegagin） 敏感性高，特异性差，易出现假阳性。(1991年首批淘汰) 性病研究实验室法(venereal disease research laboratory，VDRL) 心拟脂及卵磷酯+反应素（Aegagin） 不需加热的血清反应素试验(unheated serum reagin) 心拟脂及卵磷酯+氯化胆碱+反应素（Aegagin）,反应最适比测定,（1）抗原稀释法（Dean-Webb法） （2）抗体稀释法（Ramon法） （3）方阵法或棋盘格滴定法（checkerboard titration）,环状沉淀试验（ring pr

6、ecipitation test）,Ascoli于1902年建立 用于检查兽类内脏、毛皮浸液等标本中的炭疽杆菌抗原,免疫比浊法（immunoturbidimetry）,优点：校正曲线稳定，简便快速，易于自动化，无放射性核素污染 缺点：特异性、灵敏度稍差,免疫比浊法的分类,（1）透射比浊法（transmission turbidimetry） （2）散射比浊法（nephelometry） （3）免疫胶乳浊度测定法（immunolatex turbidimetry） （4）速率抑制免疫比浊法（rate inhibition immunoturbidimetry）,免疫沉淀技术（Immunoprec

7、ipitation assay）,关键因素,抗原的丰度 抗体的结合能力 蛋白和抗体的可接触性,应用范围,免疫共沉淀技术（Co-Immunoprecipitation assay）,结果分析,Nat Immunol. 2008 Apr;9(4):369-77.,GST PULL DOWN,结果分析,PNAS February 26, 2008 vol. 105 no. 8 2836-2841,应用范围,寻找新的相互作用蛋白 验证目的蛋白和待测蛋白是否有相互作用,免疫共沉淀的局限性,（1）难以检测低亲和力和短暂的相互作用 （2）不能够确切分辨第三种蛋白的桥联作用 （3）灵敏度不如亲和色谱高 （4）

8、需对未知蛋白的相关信息有一定了解,基因转录调控,染色质免疫共沉淀,染色质免疫共沉淀,结果分析,Mol Cancer Ther June 2010 vol. 9 no. 6 1764-1774,RNA免疫沉淀,在生理状态下对结合在RNA上的蛋白质进行免疫沉淀，然后通过基因芯片或者其它手段检测目的RNA的含量。,应用范围,研究蛋白与DNA的动态作用 研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达之间的关系 研究蛋白与RNA的相互作用,免疫沉淀中抗体的选择,免疫共沉淀技术的应用,凝胶中沉淀反应,以一定浓度（12%）的琼脂（或琼脂糖）凝胶作为介质，将抗原、抗体溶液分别放在琼脂凝胶板上并使它们彼此在凝胶中自由扩散，

9、形成浓度梯度，当抗原与抗体相遇且比例适当时，在相应位置即可出现可见的沉淀环或沉淀线。,沉淀线特点,形成沉淀线的特异性抗原抗体无法通过沉淀线，只能在沉淀线周围形成沉淀 与沉淀线无关的抗原和抗体分子则可以自由通过 沉淀线的位置与抗原抗体的浓度和迁移率有直接关系,单相免疫扩散试验（single immunodiffusion）,双向免疫扩散试验（double immunodiffusion）,沉淀线分析,沉淀线分析,免疫电泳（immunoelectrophoresis）,对流免疫电泳（counter immunoelectrophoresis）,火箭免疫电泳（rocket immunoelectrophoresis）,交叉免疫电泳（crossed immunoelectrophoresis）,免疫固定电泳（immunofixation electrophoresis）,首先将蛋白质抗原进行电泳分离，电泳后直接将抗体加于蛋白质区带表面，抗体与对应的抗原就会直接结合，形成的复合物嵌于固相支持物中。,Urine Immunofixation Electrophoresis,免疫印迹技术（immunoblotting）,基本流程,一 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 1. 收集蛋白样品：贴壁细胞、组织、药物处理细胞 2. 蛋白质浓度测定：BCA 3. 电泳：10分离胶、4的