荧光及其荧光单分子跟踪技术.ppt

1、荧光及其荧光单分子跟踪技术,2011.11,鄢志丹,荧光 什么是荧光；分子荧光的主要特性有那些； 荧光显微技术 荧光显微镜；探测传感器；荧光显微技术的应用领域； 荧光单分子检测技术 单分子检测意义；荧光单分子检测特点、应用范围和关键技术； 一种高精度快速的荧光单分子跟踪算法 图像去噪；位置估计；伪点剔除；精细定位；轨迹生成；特性评价；真空设备； 总结及思考题,主要内容:,思考题,思考题,1、什么是荧光？它有哪些主要特点？ 2、荧光如何从激发光中分离出来，它有那么主要的探测器件？ 3、单分子检测的应用领域有哪些？ 4、单分子跟踪算法分为几个重要步骤？ 5、IDGM（图像去噪高斯掩膜）与2DDGF

2、（二维直接高斯拟合）算法相比，有什么优势？ 6、荧光显微技术如何实现与真空分子生长（蒸发）技术的耦合？,荧光,荧光（ 1852年，英国科学家Stokes) ：,1/5：荧光（Fluorescence）,光致发光： 某些分子受外界可见光或紫外线激发 而出射光子的现象； 荧光和磷光： 激发态电子排布和光子发射路径不同； 荧光发射过程： 吸收、内转移、振动驰豫、荧光发射 磷光发射：系间窜越,分子荧光发射能量图,光致发光,分子荧光特性：,1/5：荧光（Fluorescence）,量子跳跃特性： 发射暗态交替的量子跳跃过程；在实验中可观察到单分子荧光强度和荧光光谱的涨落；,荧光偏振特性： 单个荧光分子因

3、其具有唯一的固有荧光和吸收跃迁偶极矩， 因而只吸收那些偏振方向与其吸收跃迁偶极矩方向一致的 光子，并发出具有一定偏振方向的荧光；,分子荧光特性：,1/5：荧光（Fluorescence）,荧光显微技术,荧光显微镜家族：,种类繁多，包括落射式荧光显微镜、全内反射式荧光显微镜、激光扫描共焦显微镜、驻波荧光显微镜、受激发射损耗荧光显微镜等； 激发样品方式不同，但荧光分离原理近似；,基本原理：利用荧光滤镜组出射一定波长的激发光激发样品以产生荧光（比激发光波长长），该荧光被物镜采集后，再次经由荧光滤镜组消除不是荧光波长的其他光，最终使荧光到达光学传感器。,落射式荧光显微镜,2/5：荧光显微技术（Fluo

4、rescence Microscopy）,特点：高灵敏度、高分子选择性、高信噪比；,荧光滤镜组：,把微弱的荧光从激发光中分离出来。,2/5：荧光显微技术（Fluorescence Microscopy）,结构图,光谱图,激发滤镜的带通波长范围必须是分色滤镜和发射滤镜的阻碍波长范围，而发射滤镜的通过波长范围在分色滤镜的通过波长范围之内； 荧光滤镜组的选择要针对所观测分子，须明确其激发光谱和荧光发射光谱特征。,探测传感器：,2/5：荧光显微技术（Fluorescence Microscopy）,荧光显微技术应用领域：,2/5：荧光显微技术（Fluorescence Microscopy）,荧光单分

5、子检测技术,3/5：荧光单分子检测技术（Fluorescence Single Molecule Detection）,为什么要进行单分子检测：,2. 单分子的特征对局部场的存在非常敏感， 可以反映局部微观环境的信息,3. 能够揭示随时间变化的分子特性,3/5：荧光单分子检测技术（Fluorescence Single Molecule Detection）,目前的主要方法：,近场方法：STM，AFM等； 远场方法：荧光显微镜； 其他方法：微流体、磁镊、光镊、超快振动谱等。,扫描隧道显微镜,原子力显微镜,3/5：荧光单分子检测技术（Fluorescence Single Molecule De

6、tection）,荧光单分子检测：,快速；非接触；多分子检测与跟踪；分子选择 性强；纳米级分辨率；光谱信息和图像信息,荧光单分子检测,3/5：荧光单分子检测技术（Fluorescence Single Molecule Detection）,荧光单分子检测的关键技术：,确保单分子的信号大于背景干扰信号 (有效减少拉 曼散射、瑞利散射及其杂质荧光所造成的干扰),在被照射的体积中只有一个分子与激发光发生相互作用（调整研究体系的浓度或密度）,一种高精度快速的荧光 单分子跟踪算法,基于荧光显微成像的单分子跟踪,多方面的单分子跟踪实验以及单分子跟踪算法的研究。如：美国埃默里大学、乔治城大学、华盛顿大学、

7、伊利诺伊卫斯理大学，英国曼彻斯特大学和瑞士生物医学图像组等,四种典型运动轨迹 （A 静态；B 简单扩散；C 单方向扩散；D 限制区域扩散,3/5：一种高精度快速的荧光单分子跟踪算法,材料科学、细胞学、生物物理、生物化学等领域 跟踪分子运动、获取运动轨迹、分析扩散方式、精确扩散速率，可得到丰富而详细的动力学和统计学信息。 分子马达特性；蛋白分子的聚核与裂解；胶体相互作用；细胞内或细胞间反应机理等,20,原始图像,图像去噪,特征点位置估计,伪点剔除,高斯掩膜精细定位,概率轨迹链接,实现快速高精度,快速高精度单分子跟踪算法,快速高精度单分子实时跟踪算法是进行实时单分子跟踪的必然要求。 该算法包括图像

8、去噪处理与高斯掩膜质心法相结合的定位算法和同时考虑等效光强和帧间最大运动位移的同分子概率链接算法。,3/5：一种高精度快速的荧光单分子跟踪算法,图像重构 A (转化为浮点型数组),散粒噪声,背景噪声: 光学器件残余荧光； 样品杂质荧光； 非焦平面杂散荧光； 瑞利散射光； CCD读取噪声、暗电流； 散粒噪声（像素噪声，离散化噪声）： CCD器件进行离散光电子计数产生的具有 泊松分布的信号,的选取很重要,用图像去噪算法去除背景噪声和散粒噪声的后，单分子图像信息便凸显出来,背景噪声,3/5：一种高精度快速的荧光单分子跟踪算法,特征点位置估计: 像素级分辨率,采用图像数学形态学处理技术中的256级灰度

9、膨胀算法来实现区域极大值的选择，在进行膨胀算法时，以w为半径创建结构圆，并将图像向上下左右四个方向外延w个像素，选择图像膨胀前后像素值的相同点即是极大值点,滤波后图像,膨胀后图像,3/5：一种高精度快速的荧光单分子跟踪算法,伪点,伪点剔除,设定一个百分比r，当极值点像素值位于全部像素值前 时r ，此极大值即为估计中心位置，否则剔除之；,特征点,3/5：一种高精度快速的荧光单分子跟踪算法,采用结合质心法和二维直接高斯拟合两种算法优点的高斯掩膜精细定位算法； 运算速度快； 精度高； 适合实时的单分子跟踪研究,精细定位,式中：,3/5：一种高精度快速的荧光单分子跟踪算法,第i个特征点在两帧间移动的实

10、际距离,相邻两帧分子可能移动的最大距离,两特征点点等效光强之差,最大可能移动距离,下一帧检测到的特征点,轨迹链接,式中：,两特征点点等效光强的平均值,链接，即在确定每帧的单分子位置坐标后，通过合理的链接算法把表示同一分子的点以时间序列的方式连接起来 以等效光强和运动位移为评价因素的概率法，是一种有效的特征点匹配方法,3/5：一种高精度快速的荧光单分子跟踪算法,荧光单分子仿真图像,实验用荧光显微成像系统配置,3/5：一种高精度快速的荧光单分子跟踪算法,IDGM与2DDGF(直接二维拟合）的比较分析,单分子定位算法精度分析一,IDGM和2DDGF算法的运算时间比较,3/5：一种高精度快速的荧光单分

11、子跟踪算法,3/5：一种高精度快速的荧光单分子跟踪算法,仿真与实验,荧光单分子跟踪研究的真空设备,3/5：一种高精度快速的荧光单分子跟踪算法,超高真空系统整体示意图,1)超高真空腔；2)真空阀门；3)传输真空腔；4)衬底/样品传输机构；5)涡轮分子泵（下接旋转机械泵）；6)分子蒸发源接口；7)椭偏仪接口；8)线性驱动真空波纹管；9)样品架；10)反射差分光谱仪接口；11)结构架；12)支撑柱；13)钛升华泵；14)悬挂弹簧；15)离子泵；16)液氦低温冷头；17)x-y平面移动平台；18)荧光显微镜；19)CCD摄像机,真空系统装配实物图,荧光单分子跟踪研究的真空设备,3/5：一种高精度快速的荧光单分子跟踪算法,5/5：总结及思考题,2、 荧光显微技术、探测传感器以及荧光显微术应用领域；,3、荧光单分子检测特点、应用范围和关键技术；,4、一种快速高精度的单分子跟踪算法的实现过程、特性评价及典型的单分子研究装置。,总结,思考题,5/5：总结及思考题,1、什么是荧光？它有