高效液相色谱操作步骤

1、高效液相色谱仪的应用,1.环境污染物分析：大气、水、土壤和食品中的多环芳烃、多环联苯，阴离子表面活性剂，有机氯农药、有机磷农药，除草剂，酚类胺类、黄曲霉毒素等污染物的分离与测定。 2.精细化工 ：在精细化工生产中使用的具有较高分子量和较高沸点的有机化合物，如高碳数脂肪族或芳香族的醇、剂、药物、农药、燃料、炸药等工业产品的醛、酮、醚、酸、酯等化工原料，以及各种表面活性分离与测定。 3.食品质量分析：农药残留，兽药残留；防腐剂、抗氧化剂、人工合成色素等食品添加剂的分离与测定，保健食品中的功效成分检测，真菌毒素分析等,前,后,高效液相色谱分析仪的型号、外形因生产厂家的不同而有较大的差异。各型号仪器配

2、有相应的数据处理系统。,1、溶剂（流动相）,真空脱气机,2、输液系统 （四元泵）,3、手动进样器,4、柱温箱 （色谱柱， 固定相）,5、检测器,6、色谱工作站,一：流动相的配制,1：有机溶剂的过滤（使用 0.45um的一次性水系滤膜过滤）,2：流动相超声脱气 （1030min）,开关,二：样品处理,1：样品过滤（过滤装置：一次型注射器;一次性滤头）进入高效液相色谱仪样品液都必须经过样品过滤装置过滤,2:把经过称量、定容、超声处理后的样品溶液，用一次性注射器和一次性滤头过滤后，加入2ml具塞试管中备用。,一次性滤头：由机系、水系组成； 滤膜的孔径为0.45um,三：色谱柱的连接,将色谱柱按流动相

3、流动方向即色谱柱标示箭头方向安装在仪器上,拧紧色谱柱的接口,色谱是一种分离分析手段，分离是核心，因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等。,四：放置流动相,1：将储存流动相的贮液瓶放置于贮液瓶架上,2：更换仪器泵头里清洗瓶中的超纯水（以确保仪器外回路系统清洁和良好的工作状态）,清洗瓶,依次打开： 稳压器 柱温箱 高压泵 检测器 计算机电源开关,五：开机,六：系统排气,1：拧松泵右侧的快速排气阀（两圈即可）,3：进入色谱工作站，待仪器自检完成后进行进样系统的清洗,4：用一次性平头微量注射器吸入12ml的样品溶液，注入手动进样阀的进样口,2：按下泵前

4、面的“排气”键排气5min后拧紧快速排气阀,色谱工作站,一次性平头微量注射器,作用：平衡活化色谱柱并清除管路中的杂质和残留的水分。 步骤：分析样品前先用甲醇或乙腈冲洗流路20min30min 如果流动相为有机相和纯水相的混合液，在用甲醇或乙腈冲洗流路后，按照分析样本的需要调节比例阀的比例，冲洗流路约20min； 如果流动相含有缓冲盐溶液、有机酸、无机酸或其他电解质，则应该用与分析样品流动相中缓冲盐溶液或有机酸、无机酸、其他电解质与有机相相同比例的水加有机相冲洗流路约20min以上，再按照分析样品的需要调节有机相与缓冲溶液等的比例冲洗流路约20min，平衡进样环境。 简而言之：根据流动相的不同选

5、择不同的溶液冲洗流路。 具体问题具体分析！,七：冲洗流路（进样前的系统准备）,八：设定分析方法,1：设置程序文件（流动相通道、流速、比例、检测器检测波长、分析时间、最高压力、最低压力） 2：设定分析方法的方法文件（文件名称，表示浓度的单位） 3：设定样品分析表（标准名称、测定次数、样品名称、编号）,4：待进样环境平衡后，打开检测器的氘灯，检测器开始自检和教正，进行基线检测，待基线平稳后进样分析。,打开检测器的氘灯,简而言之：软件的各种设置；繁杂但不复杂,九：进样分析,1：启动设置程序文件、设定分析方法的方法文件、设定样品分析表按照样品分析表的顺序，用平头微量注射器将经过0.45um滤膜过滤的标

6、准溶液和样品溶液逐次注入六通进样阀中，,2：顺时针旋转六通阀，仪器开始进行分析,1：根据样品的出峰时间定性 2：根据样品的峰面定量 （在一定的色谱操作条件下，流入检测器的待测组分的含量、质量或浓度与检测器的响应信号：峰面积或峰高成正比。）,十：数据处理,色谱图示例,1：冲洗流路和色谱柱 a:若流动相为有机相和超纯水的混合溶剂，则直接用甲醇或乙腈冲洗流路约30min，待基线无杂质峰出现走平稳后可停泵关机。 b:若流动相含有缓冲盐溶液、有机酸、无机酸或其他电解质溶，则先用5%甲醇冲洗流路3060min，其次用50%甲醇溶液冲洗流路约30min，再用甲醇或乙腈冲洗流路约30min，待基线无杂质峰出现

7、走平稳后可停泵关机。 2：冲洗进样系统 a:清洗手动进样阀，将手动进样阀的扳手逆时针扳到头，用一次性平头微量注射器吸入24ml的50%甲醇，注入手动阀的进样口。 b:每次样品测定完后，一定要用50%甲醇清洗；若样品水系，则先用超纯水清洗，再用50%甲醇清洗。,十一：仪器工作完成后的必要维护,依次关闭检测器的氘灯 将高压泵的流速降为“0” 关闭检测器开关 关闭高压泵开关 关闭仪器色谱工作站 关闭检测器电源开关 关闭高压泵电源开关 关闭柱温箱电源开关 关闭电脑开关 关闭稳压电源开关 并在仪器使用登记本上记录环境温度、湿度、仪器工作状态及使用情况 结束操作，整理实验台,十二：关机,流动相 ：1、 流

8、动相应选用色谱纯试剂、高纯水或双蒸水，酸碱液及缓冲液需经过滤后使用，过滤时注意区分水系膜和油系膜的使用范围； 2、 水相流动相需经常更换（一般不超过2天），防止长菌变质；,操作过程中应注意的事项,色谱柱：,1、 使用前仔细阅读色谱柱附带的说明书，注意适用范围，如pH值范围、流动相类型等； 2、 使用符合要求的流动相； 3、 使用保护柱； 4、 如所用流动相为含盐流动相，反相色谱柱使用后，先用水或低浓度甲醇水（如5甲醇水溶液），再用甲醇冲洗。 5、 色谱柱在不使用时，应用甲醇冲洗，取下后紧密封闭两端保存； 6、 不要高压冲洗柱子； 7、 不要在高温下长时间使用硅胶键合相色谱柱；,样品：,1、 采用过滤或离心方法处理样品，确保样品中不含固体颗粒； 2、