第二章 2DNA的结构.ppt

1、第二章 PartII DNA的结构,第一节 遗传物质的本质 第二节 核酸的化学组成 第三节 DNA的二级结构 第四节 DNA的物理化学性质 第五节 超螺旋和拓扑异构,第一节 遗传物质的本质,1、 遗传物质必须具有的特性,a、贮存并表达遗传信息,b、能把信息传递给子代,c、物理和化学性质稳定,d、具有遗传变化的能力,DNA的特征,各异的碱基序列储存大量的遗 传信息,碱基互补是其复制、转 录表达遗传信息的基础,生理状态下物理、化学性质 稳定,有突变和修复能力，可稳定遗 传是生物进化的基础,一、DNA携带两类不同的遗传信息,2、 DNA携带两种遗传信息,a、编码蛋白质和RNA的信息(编码tRNA、r

2、RNA),64个三联体密码子 三个终止密码子 编码氨基酸的61个密码子由简并性、通用性,b、编码基因选择性表达的信息,* 原核生物的结构基因占Genome的比例很大,x174phage 5386bp 结构基因用去5169bp 比例达96,* 真核生物的结构基因占Genome的比例很小,哺乳动物中结构基因只占1015,其余80以上的DNA起什么作用目前还无法精确解释，但可以肯定其中大部分DNA序列是编码基因选择性表达的遗传信息,表现在： 细胞周期的不同时相中 个体发育不同阶段 不同的器官和组织 不同的外界环境下各种基因的表达与否以及量的差异,所以又称调控序列,二、 RNA也可作为遗传物质,* R

3、NA病毒 传染媒介是病毒颗粒（病毒基因组RNA、蛋白质外壳） Tobacco Mosaic Virus (TMV),* 类病毒（viroid）: 使高等植物产生疾病的传染性因子 只由RNA组成,三、 是否存在核酸以外的遗传物质,Prion (proteinaccous infections particle) 引起的风波 朊病毒蛋白质样的感染因子,羊搔痒病 (scripie),Prion 复制? 转录? 翻译?,人类库鲁（ kuru） 病,牛海绵状脑炎(疯牛病),均由传染性病原蛋白颗粒引起,统称Prion (朊病毒),第二节 核酸的化学组成,嘧啶Pyrimidines,嘌呤Purines,一、

4、 含氮碱基、核苷、核苷酸, 碱基 Nitrogenous bases, 核苷（nucleotide）,嘧啶的1位N原子、嘌呤的9位N原子,核糖是戊糖 RNA核糖核苷 DNA脱氧核糖核苷,1,9, 核苷酸（nucleotide acid）,核苷的磷酸酯 脱氧核糖核苷酸 核糖核苷酸,Deoxynucleotides,其中和、和之间是高能磷酸键,dNTP,Ribonucleotides,核糖核苷三磷酸缩写为NTP,二、DNA分子的一级结构 (DNA sequence),1、 多聚核苷酸链 主链是核糖和磷酸 侧链为碱基,由3,5磷酸二酯键连接,2、 链的方向：同一个磷酸基 的3酯键到5酯键的方向 (5

5、3),5-UCAGGCUA-3 = UCAGGCUA 默认书写顺序53,3、 DNA一级结构的特点,a、脱氧核糖是其显著特点 DNA极其稳定的根本原因,DNA在高pH值时磷酸酯键非常稳定 只是碱基存在构像的变化变化,酮式,烯醇式,酮式,烯醇式,RNA 在高pH时则稳定性很差,由于2OH导致的水解,b、磷酸呈四面体构型，脱氧核糖呈折叠的五元环，碱基是平 面的,C、主链是亲水的，侧链（碱基）是疏水的 主链的脱氧核糖的羟基能与水形成氢键，而磷酸基团在 生理条件下离解为负离子 这些特点保证了多核苷酸链可形成稳定的构象,4、 一级结构的概念 指DNA分子中的核苷酸排列顺序 不同生物借此贮存遗传信息 决定

6、DNA的二级结构和高级结构,第二节 DNA的二级结构,一、 DNA双螺旋模型的提出（double helix model）,* 依据,a、 1938. W. T. Astbury 首次用X射线分析DNA,b、 1950 Chargaff A + G / T + C = 1 A+T G + C,c、 1952 Alexander Todd 发现了核苷酸和核苷酸之间由磷酸二酯键联接,d、 1952 M.H.F.Wilkins & Rosalind Franklin 得到了高度定向的DNA纤维的X-射线照片 发现原子长轴存在0.34和3.4nm两种周期性,此外，之前的密度测定表明螺旋由两条多核苷酸链

7、组成，且直径恒定（2nm)。,* 提出 1953. Watsosn & Crick,右手 B- DNA Double helix Model,* 双螺旋的主链,Phosphodiester Backbone,C-G,T-A,碱基互补, 直径20,* 双螺旋模型参数, 螺距为34（任一条链 绕轴一周所升降的距离）, 每圈有10个核苷酸 （碱基）, 有大沟和小沟 配对碱基并不充满双 螺旋空间，且碱基对 占据的空间不对称, 两个碱基之间的垂直 距离是3.4。螺旋转 角是36度,Major Groove,Minor Groove,10.4 bp/turn,Twist 36, 大、小沟的差异, 大沟中碱

8、基差异容易识别 ，往往是蛋 白质因子结合特异DAN序列的位点, 小沟相对体现的信息较少,二、 影响双螺旋结构稳定性的因素,l 氢键 (Hydrogen bond 46 kc / mol),消除DNA单链上磷酸基团间的静电斥力,弱键, 可加热解链,氢键堆积, 有序排列(线性, 方向),l 磷酸酯键 (phosphoester bond 8090 kc / mol),l 0.2 mol / L Na+ 生理盐条件,强键, 需酶促解链,* 维持稳定性的因素,l 碱基堆积力 (非特异性结合力),( 1 kc / mol 0.6kc / mol ) n, 范德华力（Van de waals force）

9、 (1.7A/ 嘌呤环与嘧啶环 作用半径),(0.34 nm/碱基对间距), 疏水作用力 (Hydrophobic interaction),不溶于水的非极性分子在水中相互联合, 成串结合的趋势力. 即熵 值(Entrophy)S上升-热力学上的稳定态,成为碱基间的部分堆积力,(磷酸骨架, 氨基, 酮基周围水分子间的有序排列 ),非极性分子间（嘌呤和嘧啶碱基）的相互成串结合 熵值 上升(S going up),l 磷酸基团间的静电斥力,碱基内能增加(温度), 使氢键因碱基排列有序状态的破坏 而减弱,* 不稳定因素,三、双螺旋结构的基本形式, B-DNA 资料来自相对湿度为92所得到的DNA钠盐

10、纤维, 此外人们还发现了A、C、D、E等右手双螺旋和左手双螺旋 Z构象等形式,DNA结构的多态性：几种不同的DNA双螺旋结构以及同 一种双螺旋结构内参数存在差异的现象,原因：多核苷酸链的骨架含有许多可转动的单键 磷酸二酯键的两个P-O键、糖苷键、戊糖环各个键,戊糖的构象,A DNA,B DNA,A,B,Z,A,B,Z,大沟宽,小沟窄,小沟窄,大沟变深,小沟宽深,大沟不存在,小沟窄而深,1、反向重复序列与二级结构 反向重复序列（inverted repeatitive sequence or inverted repeats IR） 又称回文序列（廻文）：指两段同样的核苷酸序列同时存 在于一个分

11、子中，但具有相反的方向 有时也有不完全相同的情况 RNA和DNA中都可能存在 此外还可有directed repeatitive sequence -正向重复序列,四、一些DNA序列的不寻常结构,C,反向重复序列间间隔较短或无间隔,反向重复序列间间隔较长,课内容回顾:,1、 碱基、核苷、核苷酸的化学组成,2、核酸的一级结构 书写方向,3、Watson Crick 的Double Helix Model 参数 大小沟 二级结构的多态性,4、影响二级结构的作用力：稳定因素 不稳定因素,5、DNA序列的不寻常结构：反向重复序列,* 较短的回文序列可能是作为一种信号 如：限制性内切酶的识别位点 一些调

12、控蛋白的识别位点,2、三螺旋DNA (Trible Helix DNA, T.S DNA),例如限制性内切酶 EcoR的识别位点 5GAATTC3 3CTTAAG5,（1） 发现和证实, 1953 年 Watson & Crick D.S DNA model 证明沿大沟存在多余的氢键给体与受体,潜在的专一与DNA (蛋白质)结合的能力,形成T.S DNA 可能性,这些发现促进了三螺旋DNA的研究,（2） 形成条件 第二股中间链必须是嘌呤链 第三股链至少长于八个核苷酸, 1957 Felsenfeld等 发现一股为嘌呤，另一股为嘧啶的核 苷酸双链能够形成三链 如： polyA/polyU pol

13、ydA/polydT polyd (AG)/polyd(CT), 1987 年 Mirkin . S . M,证明plasmid DNA 在 pH= 4.3的溶液中, 有T.S DNA的存在,三螺旋DNA的概念提出,a、 D.S. DNA + D.S.DNA,T.S. DNA + S.S. DNA,（3） 组成形式, 双链DNA的同源回文序列形成的三链DNA（镜向重复）,Mirkin (1987) pGG332 plasmid DNA,b、分子组成 PY/PU + PU (偏碱性介质中稳定) GG 、 AA 、 GA PY/PU + PY (偏酸性介质中稳定) 常见类型 GC AT,第三条链位

14、于B-DNA的 Major groove中,H-DNA,两种异构体,T. S. DNA 的连接键,Watson bonding A T G C (D. S. DNA),H+,Hoogsteen 氢键 G C+(质子化 ) (第三链 , pH 小于7),三股螺旋DNA结构特点总结,第三条单链DNA分子 位于B-DNA大沟内,与B-DNA以 Hoogsteen 键连接,poly(Py) : (Pu) : (Py)为常见类型,* 可能功能 可能与基因调控区域的功能和染色体重组有关,3、 四股螺旋DNA ( tetraplex DNA, Tetrable Helix DNA ),发现,1958. Po

15、ly(G) X-ray photograph,碱基形成环状氢键连接结构,Tetrable Helix DNA,均有形成 四股螺旋DNA 的可能,形成条件串联重复的鸟苷酸, 已有实验结果表明真核细胞端粒中存在四链结构,结 构 特 点,碱基之间靠 Hoogsteen 键连接,基本结构单元鸟嘌呤四联体,可能的功能,A、 稳定真核生物染色体结构,B、 保证DNA末端准确复制,C、 与DNA分子的组装有关,D、 与染色体的 meiosis & mitosis 有关,第四节 DNA的物理、化学性质,一、DNA分子的变性,DNA双股链的互补是其结构和功能上的一个基本特征， 也是DNA研究中一些实验技术的基础

16、,变性（denaturation 或融解 melting）：DNA双螺旋区的 氢键断裂，使双螺旋的两条链完全分开变成单链，这 一链分离的过程叫做变性,1、条件：加热, 极端pH,有机溶剂（ 尿素、 酰胺 )，低盐浓度等,2、变性过程的表现 是一个爆发式的协同过程，变性作用发生在一个很 窄的温度范围 导致一些理化性质发生剧烈变化, 熔液黏度降低 沉降速度加大 浮力密度上升 此外吸收值升高（A260nm），即增色效应 指在DNA变性的过程中，他在260nm的吸收值先是缓慢 上升，达到某一温度时及骤然上升,天然DNA和变性DNA的吸收值相差可达34,当浓度为 50g/ml时：,1.185,3、熔解曲

17、线与Tm值 缓慢而均匀地增加DNA 溶液的温度（现可做到 0.1 分）可根据各 点的A260值绘制成DNA 的熔解曲线,这也是一般PCR实验技术中把变性温度定为94 的原因,1、 影响 Tm值的因素,（1） 在 A, T, C, G 随机分布的情况下 ，决定于GC含量,（2）GC%含量相同的情况下,GC%愈高 Tm值愈大,GC%愈低 Tm 值愈小,AT形成变性核心，变性加快，Tm 值小,碱基排列对Tm值具有明显影响,36.7 57.02 ,Tm,136.12 72.55 , 嘌呤嘧啶的排列顺序对双螺旋结构（稳定性）的影响,即氢键数目相同，但相邻碱基的堆积力不同 从嘌呤到嘧啶方向的碱基堆积力作用

18、显著地大于 同样组成的嘧啶到嘌呤方向的碱基堆积作用,Pyrimidine-Purine Steps Have Little Base Stacking,5 CA 3 3 GT 5,Purine-Pyrimidine Steps Have Extensive Base Stacking,5 AC 3 3 TG 5, 生物体内仅UAA为最有效的终止密码子,因为：,UAA,AUU,的Tm值是最低的一个，即使生 理温度下也不稳定,（3） 大片段D.S DNA分子之间比较,片段长短对Tm值的影响较小, 与组成和排列相关,（4） 小于100bp 的 D.S DNA分子比较,片段愈短， 变性愈快，Tm值愈小

19、,（5） 变性液中含有尿素，甲酰胺等,（6） 盐浓度的影响,pH 12,酮基 烯醇基,pH 2-3,NH2 NH2+ (质子化),改变氢键的形成与结合力,（7） 极端pH条件的影响,一切减弱氢键， 碱基堆积力的因素 均将使Tm 值降低,2、 常用的变性方法, 热变性, 碱变性,应用广泛，特别是用于变性动力学研究,缺点：高温引起磷酸二酯键的断裂，得到长短不一的单链,pH11.3时，全部氢键被淘汰,无热变性的缺点，为制备单链DNA的首选方法, 保存单链DNA的条件 保持pH大于11.3 盐浓度低于0.01mol/L,D.S DNA,S.S DNA,Denaturation , Renaturati

20、on,复性过程依赖于单链分子间的随机碰撞 ( Depends on the collision of complementary S.S. DNA ),二、DNA分子的复性 （anneal or renaturation）,概念：变性DNA在适当条件下，两条彼此分开的链又可以 重新地合成双螺旋结构的过程（退火）,影响DNA复性过程的因素 ：, S.S, DNA 的初始浓度 C0, DNA 分子中, dNTP 的排列状况 (随机排列, 重复排列),3-ATCTATGCTGTCAT-5,5-TAGATACGACAGTA-3,5-TAGATACGACAGTA-3,3-ATCTATGCTGTCAT-5

21、,3-ATATATATATAT-5,5-TATATATATATA-3,3-ATATATATATAT-5,5-TATATATATATA-3,5-TATATATATATA-3,3-ATATATATATAT-5,3-ATATATATATAT-5,5-TATATATATATA-3,三、杂交（hybridization）,概念：不同来源的两个互补核酸序列通过相互退火形成 双螺旋结构的反应,DNA与RNA DNA与DNA,杂交分子,DNARNA DNADNA, 用途 检测DNA的缺失、插入，考察不同生物种类在进化中的关系,其中不连续基因的发现就是通过mRNA与DNA杂交试验而发现的, 杂交形式 固相杂交（

22、滤膜） 液相杂交, 检测方法 电子显微镜观察 放射性自显影,四、富含AT序列和DNA双螺旋结构的呼吸作用, 高等生物染色体的某一区段，AT含量变化很大,很多有重要调节功能的的DNA区段都富含AT （原核、真核 复制起点、 启动子、终止子等区域）, DNA双螺旋结构的呼吸作用：DNA双螺旋结构内部， 配对碱基的氢键的迅速断裂 和再生的过程,这已通过甲醛变性试验得到证实,* 甲醛只能和自由氨基起 反应,含 4甲醛的DNA溶液的变性图（T为25）,* 并且甲醛能使DNA发生 不可逆变性, 甲醛要与全部的氨基反应需要相当长的时间, DNA内富含AT区段呼吸作用尤为明显 这对于某些特殊的蛋白质与DNA发

23、生反应并阅读链 内部的信息具有重要作用,第五节 超螺旋和拓扑异构,一、超螺旋（superhelix OR supercoil）,最早在SV40和多瘤病毒 中发现, 超螺旋是所有线性或环 形DNA的共有的重要特征,The supercoils of the SV40 minichromosome can be relaxed to generate a circular structure, whose loss of histones then generates supercoils in the free DNA.,1、 超螺旋结构的方向性,正超螺旋（positive supercoile

24、d ）,导致左手超螺旋,以一根绳子做实验： 原来的绳子的两股以右旋方向缠绕；在绳子的一端向紧缠方向捻转，再将绳子的两端连接起来，则产生一个左旋的超螺旋以解除外加捻转的协变,负超螺旋（Negative Supercoiled ）,导致右手超螺旋,在绳子的一端向松缠方向捻转，再将绳子的两端连接起来，则产生一个右旋的超螺旋以解除外加捻转的协变,超螺旋的形成总是要向着抵消初级螺旋改变的方向发展,所有生物的DNA几乎 有5%为 Negative Superhelix,？, DNA在水溶液中, 构型偏B型状态, DNA以10.5 bp/helix为最稳定构型, 小于10.5bp/helix 向正超螺旋发展(紧缩态), 大于10.5bp/helix 向负超螺旋发展(松弛态) 天然的