聚丙烯酰胺凝胶电泳.ppt

1、聚丙烯酰胺凝胶电泳,作用,聚丙烯电泳是生物学科的1 项基本技术，被广泛运用到氨基酸、多肽、蛋白质( 活性蛋白或同工酶) 、核酸的分离和鉴定。,聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂的作用下，聚合交联而成的含有酰胺基侧链的脂肪族大分子化合物。 聚丙烯酰胺凝胶具有三维网状结构，能起分子筛作用。用它作电泳支持物，对样品的分离取决于各组分所带电荷的多少及分子大小。此外，聚丙烯酰胺凝胶电泳还具有浓缩效应，即在电泳开始阶段，由于不连续pH梯度作用，将样品压缩成一条狭窄区带，从而提高了分离效果。 聚丙烯酰胺凝胶电泳分为垂直平板电泳和圆盘电泳，两者的原理完全相同。

2、由于垂直板形凝胶具有板薄、易冷却，分辨率高、操作简单、便于比较与扫描等优点，因而为大多数实验室采用。聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率比纸电泳高得多，能检出10-910-12g样品，特别适合于分离和测定蛋白质、核酸等生物大分子化合物。它除了能对生物大分子物质进行定性、定量分析外，还可用以测定分子量，且是一种较先进的测定分子量的方法。,实验原理,聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acrylamide，Acr）和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下合成。 聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有电荷效应、分子筛效应。,电荷效应（电泳物所带电荷的差异性） 分子筛效应（凝胶的网状结构及电泳物 的

3、大小形状不同所致）,变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）,（根据亚基分子量分离蛋白质）,（根据蛋白质的分子量、形状、电荷来分离蛋白质）,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（native-PAGE）,SDS-PAGE的基本原理 1.蛋白质分子的解聚 (1)SDS （十二烷基硫酸钠，sodium dodecyl sulfate, SDS),断裂分子内和分子间的氢键 分子去折叠 破坏蛋白质分子的二级和三级结构,阴离子去污剂 变性剂 助溶性试剂,(2)强还原剂 巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，这样分离出的谱带即为蛋白质亚基。,SDS和还原剂的作用： （1）分子被解聚成组成它们

4、的多肽链 （2）氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束；蛋白质-SDS胶束所带的负电荷达到超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子之间原有的电荷差异。,连续电泳 不连续电泳,电荷效应 分子筛效应,PAGE,电荷效应 分子筛效应 浓缩效应：不连续性所致,电泳体系中所用的缓冲液成分、pH、凝胶浓度相同,缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度呈不连续性,不连续SDS-PAGE,原理,凝胶的不连续性 缓冲离子的不连续性 pH的不连续性 电位梯度的不连续性, 凝胶的不连续性： 浓缩胶：大孔径。样品在其中浓缩，并按迁移率递减的顺序逐渐在其与分离胶的界面上积聚成薄层。 分离胶：小孔

5、径。蛋白质分子在大孔胶中受到的阻力小，移动速度快，进入小孔胶时遇到的阻力大，迁移速度减慢。由于凝胶的不连续性，在大孔胶和小孔胶界面处就会使样品浓缩，取带变窄。, 缓冲离子的不连续性 pH的不连续性 电位梯度的不连续性,操作步骤,制板,制分离胶,制浓缩胶,电泳槽安装,加样,电泳,剥胶,固定,染色,脱色,结果观察,（1）在聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶,并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。小心避免混入气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。 （2）浓缩胶聚合完成后（30分钟），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸电极缓冲液。 4.样品制备 取

6、0.5ml稀释血清（血清用H2O2稀释一倍）加入0.5ml 2SDS凝胶加样缓冲液混匀，在100水浴中加热3分钟使蛋白质变性。10,000rpm离心1分钟，取上清加样。 5.加样及电泳 用长皮头吸嘴吸取处样品50l，从加样孔底部缓慢加样。 注意：加样时不得插伤凝胶孔胶面，不得产生气泡、样品不得溢出加样孔。,6.接电源与电泳 上槽接负极，下槽接正极。调节电压至80V电泳至样品前沿刚好进入分离胶后，把电压提高到120V（凝胶上所加电压约为8V/cm），继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1cm（约23小时），然后关闭电源，取出插头。 7.剥胶 从电泳装置上御下玻璃，用水果刀撬开玻璃板。并用刀在紧

7、靠最左边一孔凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。 8.染色与脱色 用考马斯亮蓝染液对SDS聚丙烯酰胺凝胶进行室温染色12小时后，用脱色液在脱色摇床上脱色34次，每次2030分钟。 血清蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离可以产生十多条色带。,实验注意事项 1.丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤，操作时应免避沾在脸、手等皮肤上。最好戴一次性塑料手套操作。 2.过硫酸铵的主要作用是提供自由基引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合反应，故一定要新鲜，贮存过久的过硫酸铵商品不能使用。此外，10%过硫酸铵必须现用现配，4OC冰箱贮存不超过48小时。 3.灌制凝胶时，应避免产生汽泡，因为汽泡会影响电泳分离效果。 4.刚灌注分离胶混合溶液后，应在分离胶液面上加12cm