实验一 核酸提取及琼脂糖电泳.ppt

1、核酸提取及琼脂糖电泳,核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作 。,DNA提取的几种方法,染色体DNA的提取,CTAB法 SDS法 其它,基因组DNA CTAB法,CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）,CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。 该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。,注：

2、CTAB溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。,基因组DNA CTAB法,CTAB提取缓冲液的经典配方,Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； -巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除,CTAB提取缓冲液的改进配方,PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA

3、中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。,CTAB法流程图,基因组DNASDS法,SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（5565）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀； 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。,SDS法原理,SDS法DNA提取缓冲液,SDS法流程图 （以动物组织为例）,基因组DNA其它方法,根据细胞裂解方式的不同有：,物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法 化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 生物方式：酶法,根据核酸分离纯化方式的不

4、同有：,吸附材料结合法：,硅质材料 阴离子交换树脂 磁珠,高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 快捷高效。,低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。 适用于纯度要求高的实验。,磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。,浓盐法： 有机溶剂抽提法： 密度梯度离心法：,利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离,有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用,利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物,基因组DNA其它方法,DNA提取的基本步骤,I.材料准备 II.破碎细胞或包膜内容物释放 III.核酸分离、纯化 IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质 V.核酸溶解在适量缓

5、冲液或水中,材料准备,基因组DNA的提取,最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融 提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞） 组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解 含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集,细胞裂解,材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式： 植物材料液氮研磨 动物组织匀浆或液氮研磨 组培细胞蛋白酶K 细菌溶菌酶破壁 酵母破壁酶或玻璃珠 高温温浴时，定时轻柔振荡,基因组DNA的提取,核酸分离、纯化,基因组DNA的提取,采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系 采用有机（酚/氯仿）抽提

6、时应充分混匀，但动作要轻柔 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法,核酸分离、纯化,蛋白质的去除： 酚/氯仿抽提 使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等） 高盐洗涤 蛋白酶处理,核酸分离、纯化,多糖的去除： 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。 用多糖水解酶将多糖降解。 在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。 用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500L DNA液中加入200l 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20mi

7、n。,核酸分离、纯化,多酚的去除： 在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合,盐离子的去除： 70的乙醇洗涤,核酸沉淀、溶解,基因组DNA的提取,当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分 沉淀时加入1/10体积的NaOAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀 沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等 晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥） 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解 TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase

8、 pH值为8.0，可防止DNA发生酸解,DNA提取常见问题,问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。,原因,DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质 DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应 DNA中残留有金属离子,对 策,重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前） 重新沉淀DNA，让酒精充分挥发 增加70乙醇洗涤的次数（2-3次）,DNA提取常见问题,问题二：DNA降解。,原因,材料不新鲜或反复冻融 未很好抑制内源核酸酶的活性 提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断 外源核酸酶污染 反复冻融,对 策,尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融 液氮研磨或匀浆组织后，

9、应在解冻前加入裂解缓冲液 在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量 细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌 将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融,DNA提取常见问题,原因,问题三：DNA提取量少。,实验材料不佳或量少 破壁或裂解不充分 沉淀不完全 洗涤时DNA丢失,对 策,尽量选用新鲜（幼嫩）的材料 动植物要匀浆研磨充分；G菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁 高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量） 低温沉淀，延长沉淀时间 加辅助物，促进沉淀 洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒,动物组织细胞基因组DNA

10、提取,2. 试剂： 1、 TE: 10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0)。 2、 裂解缓冲液：250mM SDS; 使用前加入蛋白酶K至 100mg/ml。 3、 20% SDS 4、 2mg/ml蛋白酶K 5、 Tris饱和酚（pH 8.0）、酚/氯仿/异戊醇 6、 无水乙醇、75%乙醇 7、 TAE电泳缓冲液,实验操作,材料处理1、 新鲜或冰冻组织处理 取组织块0.3-0.5cm3, 剪碎，加TE 0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。 将匀浆液转移到1.5ml离心管中。 加20% SDS 25l，蛋白酶K (2mg/ml) 25l，混匀。 65C水浴

11、30min。于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。,DNA提取 加等量的酚/氯仿/异戊醇至上述样品处理液中振荡混匀，离心12000 rpm，5min。 取上层溶液至另一管，加入等体积的氯仿/异戊醇，振荡混匀，离心12000 rpm，5min。 取上层溶液至另一管，加1/10体积的3M醋酸钠（pH 5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀室温沉淀2min ，离心12000 rpm ,10min。 小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。 用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ，10min。 小心倒掉上清液，将离

12、心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。 加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4或-20保存备用。,DNA及RNA含量测定,取少量待测DNA(RNA)样品，用TE或蒸馏水稀释50倍（或100倍）。 用TE或蒸馏水做空白，在260 nm、280 nm、310 nm处调节紫外分光光度计的读数至零。 加入待测DNA(RNA)样品在三个波长处读取OD值。 纯DNA样品的OD260/OD280 大约为1.8，高于1.8可能有RNA污染，低于1.8有蛋白质污染；纯RNA 样品的OD260/OD280 大约为2.0。 根据OD值计算DNA（RNA）浓度或纯度。 SSDNA=33（OD2

13、60-OD310）稀释倍数 dSDNA=50（OD260-OD310）稀释倍数 SSRNA=40（OD260-OD310）稀释倍数,DNA及RNA含量测定,琼脂糖凝胶电泳原理及方法,天然琼脂（agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（agarose，约占80%）及琼脂胶（agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷，而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象。因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。 琼脂糖凝胶电泳常用于分离、鉴定核酸: 如重组质粒的鉴定，DNA酶谱制作等。,琼脂糖凝胶的特点,琼脂糖电泳

14、优点： 操作简单，电泳速度快，样品处理容易。 样品吸附极微，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。（琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98%99%），近似自由电泳，样品扩散较自由。） 无紫外吸收，可直接用紫外光灯检测及定量测定。 易染色，易洗脱样品，便于定量测定。制成干膜可长期保存。,DNA的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要是依据它们的相对分子量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。1、核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系 不同大小的DNA需要不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。,2、核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系不同构型DNA的移动速度次序为： 供价闭环DNA直线DNA开环的双链

15、环状DNA,3、电泳方法（1）电泳类型 用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型（平板型）。水平型电泳时，凝胶板完全浸泡在电极缓冲液下1-2mm，故又称为潜水式。目前更多用的是后者，因为它制胶和加样比较方便，电泳槽简单，易于制作，又可以根据需要制备不同规格的凝胶板，节约凝胶，因而较受欢迎。,（2）缓冲液系统 缺少离子时，电流太小，DNA迁移慢；相反，高离子强度的缓冲液由于电流太大会大量产热，严重时，会造成胶熔化和DNA的变性。 常用的电泳缓冲液有EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸（TAE），Tris-硼酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE）等，浓度约为50mmol/L(pH7.57

16、.8)。 电泳缓冲液一般都配制成浓的贮备液，临用时稀释到所需倍数。,（3）凝胶的制备 以稀释的电泳缓冲液为溶剂，用微波炉配制一定浓度的溶胶，灌入水平胶框或垂直胶膜，插入梳子，自然冷却。,（4）样品配制与加样 DNA样品用适量Tris-EDTA缓冲液溶解，缓冲液内含有0.25%溴酚蓝或其他指示染料，,含有10%-15%蔗糖或5% 10%甘油，以增加其比重，使样品集中。,（5）电泳 低电压下，分离效果较好。在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。因此为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不宜高于5V/cm。电泳系统的温度对于DNA在琼脂糖凝胶中的电泳行为没有显著的影响。通常在室温下进行电泳，只有当凝胶浓度低于0.5%时，为增加凝胶硬度，可在4进行电泳。,（6）染色和拍照 常用荧光染料溴乙锭（EB）染色，在紫外光下观察DNA条带，用紫外分析仪拍照，或用凝胶成像系统输出照片，并进行有关的数据分析。,琼脂糖电泳注意问题,融胶时非常热，小心烫手，另外注意不要加热过度使胶冲出瓶子。因此注意选择起码为胶体积2倍以上的瓶子。保证胶混匀和完全溶解，减少可能因此引起的胶中孔径不均匀影响分离效果。 倒胶的时候制胶的桌面相对水平。倒胶时尽量减少气泡的产生。EB如果在制胶时加入，