生防菌NH-BS-2000对西瓜枯萎病的防治效果及其促生作用

1、生防菌NH-BS-2000（Bacillus subtilis）对西瓜枯萎病的防治效果及其促长作用朱育菁，葛慈斌，蓝江林，林抗美，肖荣凤收稿日期：2007-04-10基金项目：国家高技术研究发展计划（863计划）（2006AA10A211）；福建省自然科学基金(2006J0068)；福建省发改委重点项目(闽发改投资2006781号)，福建省科技厅闽宁合作项目（2004Y034）。作者简介：朱育菁（1972），女，博士，主要从事植物病虫害生物防治研究。（福建省农科院生物技术研究所，福建 福州 350003）摘 要：为了实现对西瓜枯萎病进行生物防治，研制出能替代化学农药的生物农药，本研究进行枯草芽

2、孢杆菌NH-BS-2000对西瓜枯萎病的防治效果及促长作用的田间小区试验。试验结果表明：生防菌NH-BS-2000对西瓜苗期枯萎病的防治效果可达61.62%，高于化学药剂三环唑和维线克41.65%和37.55%，表现在能促进植株根部的生长。在处理30 d后，生防菌处理组对西瓜枯萎病的防治效果达83.14%，显著高于三环唑处理组和维线克的18.09%和25.53%，表明生防菌比化学农药具有更长的持效期，同时还能促进西瓜植株的株高、叶片数、着花数、座果数、叶长和叶宽等的生长。说明NH-BS-2000菌株具备作为枯萎病生防菌的良好优势，有望开发出瓜类枯萎病的生防菌剂。研究还发现生防菌NH-BS-20

3、00的施用影响了土壤根际的微生物群落，显著提高了放线菌的含量。关键词：生防菌NH-BS-2000；枯草芽孢杆菌；西瓜枯萎病；防治效果；促长作用 中图分类号： 文献标识码： 文章编号：Control Efficacy of Biocontrol Strain NH-BS-2000 (Bacillus subtilis) against Wilt Disease of Watermelon and its Promoting Effect on the Growth ZHU Yu-jing, GE Ci-bin, LAN Jianglin, LIN Kanmei, XIAO Rong-feng,

4、LIU Bo(Institute of Biotechnology, Fujian Academy of Agricultural Sciences，Fuzhou 350003，China)Abstract：The field experiment on the control efficacy of biocontrol strain NH-BS-2000 (Bacillus subtilis) against wilt disease of watermelon and its promotiong effect on the growth was conducted at Fuzhou,

5、 Fujian, China. The result showed that the control efficacy of NH-BS-2000 against the wilt disease of watermelon seedlings was 61.62%, higher than 41.65 nad 37.55% of chemical fungicide Tricyclazole and Weixianke, respectively. At 30 days after treatments, NH-BS-2000 had a control efficacy of 83.14%

6、, which was significantly greater than 18.09% of Tricyclazole and 25.53% of Weixianke, and it also promted the development of plant height, leaf number, flower number, fruit number, leaf height and leaf width. The results indicated that NH-BS-2000 could be a good biocontrol strain for the developmen

7、t of a bio-fungicide against wilt disease of melon. Besides, the usage of NH-BS-2000 increased the number of actinomycete at the rhizospheric soils of watermelon seedlings.Keywords：Biocontrol strain NH-BS-2000; Bacillus subtilis; wilt disease of watermelon; control efficacy, promoting effect on grow

8、th西瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporum Schl. f. sp. Niveum (EFSmith) Snyder et Hansen）引起的维管束病害，通过土壤、种子传播。厚垣孢子在土壤中存活10年以上，离开寄主的情况下也能存活56年1。西瓜枯萎症状表现在幼苗定株以后，开始出蔓到果实半大期间，茎的内部变为褐色全蔓或部分支蔓白天萎蔫，夜间恢复正常，5 d6 d后即枯死，是造成西瓜减产的重要病害2。对于西瓜枯萎病的防治，田间主要采用轮作和化学药剂，尤其是化学药剂防治目前是西瓜枯萎病防治的主要手段3。但由于该病属土传病害，容易使病原菌产生抗药性，给防治工作带来困

9、难，造成田间防治效果普遍较差，而且杀菌剂易造成农药残留，对生态环境和人体健康造成危害。因此，在防治西瓜枯萎病的诸多措施中，生物防治由于具有见效快、无污染等优点成为重要的防治方法之一4。20世纪80年代以来，国内外植病生防中对枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的报道较多，涉及的防治对象有作物的叶部病害、土传病害和果实病害。生防枯草芽孢杆菌对人畜无害，不污染环境，培养方便，生长周期短，并能产生杆菌肽、大环脂、环脂、类噬菌体颗粒等多种抗菌物质，可在根系土壤中繁殖，极具开发应用价值5。在西瓜枯萎病生物防治的研究中，国内外已报道的生防菌有弱毒或非致病性的尖孢镰刀菌、菌根菌、木霉、假单胞菌

10、、芽孢杆菌、放线菌及其产生的抗生素等，其中研究最多的也是枯草芽孢杆菌6-8。枯草芽孢杆菌NH-BS-2000菌株是本中心从西瓜根际土壤分离得到的一个拮抗菌株，经试验表明该菌株对镰刀菌具有很强的抑制作用，并完成了菌株的室内生物活性测定、液体发酵条件的研究9。为了探讨该菌株在田间的防治效果以及对西瓜苗的促长作用，本中心于2005年福建省福州永泰进行了生防菌NH-BS-2000防治西瓜枯萎病的田间试验，现将结果报道如下。1 材料与方法1.1 材料供试菌株为生防菌NH-BS-2000（Bacillus subtilis），由福建省农科院生物技术研究所生物农药研究中心菌种室提供。对照药剂为20%三环唑可

11、湿性粉剂（常州市丰登农药厂生产），维线克微胶囊剂（福建省绿波生化有限公司试产）。试验地点为福州永泰。供试作物为西瓜（品种，早春红玉），2月25日浸种，2月26日营养袋播种，3月24日移栽。1.2 方法1.2.1 生防菌NH-BS-2000发酵液的制备生防菌NH-BS-2000培养基为牛肉膏-蛋白胨（NA）培养基，发酵罐为本室自行设计的70 L NH-SF01型网络监控生物反应器。发酵采用二级发酵：将斜面保藏的NH-BS-2000菌种接种到新鲜的斜面培养基上，经30活化培养18 h后制成菌悬液，按5%接种量接种到种子罐；种子发酵12 h后，将种子液移入网络监控生物反应器发酵，发酵参数为搅拌器转速

12、220 rmin-1，pH值7.5，罐温301。每隔8 h取样一次，用血球计数法测定各样品的菌体数。生防菌NH-BS-2000发酵液最终含量为3.31010cfu/g。1.2.3 田间小区试验试验时间2005年2-4月。试验共设3个处理：生防菌NH-BS-2000发酵液50倍液灌根，三环唑600倍液灌根，维线克800倍液灌根；于3月11日用各处理液浇灌在营养袋内的西瓜苗；3月24日对刚移栽后的西瓜苗进行灌根处理，每株苗药液施用量为250 mL。每个处理约17株苗为一个小区，在大棚内随机排列，各处理重复5次，以清水为对照。施肥与田问管理均按常规进行。1.2.3 生防菌NH-BS-2000对西瓜苗

13、期枯萎病的防治效果及对土壤微生物群落的影响于4月7日调查西瓜苗的生长状况，计算各处理与对照西瓜苗的发病株率。按多点取样法，于各处理与对照发病西瓜苗根际020 cm范围内挖取土样，每种处理样点不少于5个，混合均匀后带回，过筛置5冰箱中备用；同时取样生防菌NH-BS-2000处理组的健康植株根际土壤为对照。根据邓欣等（2005）方法检测真菌、细菌和放线菌10，观察不同处理对土壤微生物群落的影响。1.2.4 生防菌NH-BS-2000对西瓜成株期枯萎病的防治效果及其促长作用于4月24日调查已成株西瓜植株的生长状况，根据病害发展程度确定发病级别；计算各小区的发病株率，调查防治效果；同时，每小区取样健康

14、植株5株，测量株高（最长茎蔓的长度）、叶片数、着花数、着果数、叶长、叶宽，调查不同处理对西瓜植株的促长效果。发病分级标准：0级：健株，长势良好无病症；1级：病株叶片自下而上逐渐萎蔫，似缺水状，中午更为明显，早晚尚能恢复；2级：病株叶片萎蔫，不能再恢复正常；3级：整株叶片呈发黄枯萎下垂，不能再恢复正常，叶片枯黄至全株死亡。防治效果=对照发病株率处理发病株率100%对照发病株率2 结果与分析2.1生防菌NH-BS-2000对西瓜苗期枯萎病的防治效果及对土壤微生物群落的影响2.1.1 对西瓜苗期枯萎病的防治效果 试验结果见表1。用生防菌NH-BS-2000、三环唑和维线克三种药剂灌根处理刚移栽的西瓜

15、苗，14d后西瓜苗的死亡率分别为7.2%、11.3%和12.0%，均显著低于对照的19.6%（P 0.01），其中生防菌NH-BS-2000的校正防效为61.62%，高于三环唑的维线克的41.65%和37.55%。表1 生防菌NH-BS-2000，三环唑和维线克对西瓜苗枯萎病的防治效果Table 1 Control efficacy (%) of NH-BS-2000, Tricyclazole and Weixianke against wilt disease of watermelon seedlings处理西瓜苗总数（株）死亡数（株）死亡率（%）防治效果（%）A-生防菌8167.40b

16、61.62B-三环唑80911.25ab41.65C-维线克831012.04ab37.55对照831619.28a*表示在同一栏内，带相同字母的数字在Duncans新复极差测验的多重比较P 0.01时没有显著差异2.1.2 对土壤微生物群落的影响对3种处理以及清水对照的发病植株采样分析发现（图1），生防菌BS-NA2000处理组苗长势均较其它处理组健壮，根系较发达，有部分根系受侵染后变褐；三环唑处理组苗长势较弱，根系不发达，受侵染后根部变褐；维线克处理组苗长势最弱，根系不发达；清水对照组根系较发达，但是根部也被侵染成褐色。图1 不同处理组西瓜苗发病株生长情况Fig. 1 The develo

17、pment of watermelon seedlings in different treatments由左至右依次为：A三环唑处理株；B生防菌NH-BS-2000处理株；C 维线克处理株；G 清水对照株土壤微生物群落的分析结果见表2。在各处理及对照的发病死亡西瓜苗的根际土壤，都存在着较高的镰刀菌含量，其中又以维线克处理和对照的为最高，达到3.8103cfu/g；在生防菌NH-BS-2000处理的健康西瓜苗的根系土壤中，镰刀菌的含量也达到2.5103cfu/g，与该处理病株根系土壤的镰刀菌含量相同。病株根际土壤中其它真菌与细菌的种类和含量与健康苗之间差别不明显；但在放线菌含量方面，健康苗根际

18、土壤的放线菌含量（8.5106cfu/g）与病株根际土壤的放线菌含量之间差异显著，例如，比生防菌NH-BS-2000处理病株的3.4106cfu/g高2.5倍，比三环唑处理病株的0.08106cfu/g高106.25倍。表2 不同处理发病与健康植株根际土壤的微生物种类和数量Table 2 Species and numbers of mircoorganism in rhizospheric soils of diseased and health plants in different treatments 土样镰刀菌其它真菌细菌放线菌种类数量（cfu/g）种类数量（cfu/g）种类数量（c

19、fu/g）种类数量（cfu/g）生防菌NH-BS-2000处理病株12.5103161.9105293.210773.4106三呸唑处理病株22.5103190.9105260.810730.08106维线克处理病株13.8103172.6105282.210742.3106对照株23.8103182.0105301.610750.8106生防菌NH-BS-2000处理健康植株22.5103151.8105272.110768.5106 2.2 生防菌NH-BS-2000对西瓜成株期枯萎病的防治效果及其促长作用2.2.1 对西瓜成株期枯萎病的防治效果试验结果见表3。在处理后30d，清水对照的西

20、瓜植株的发病率为79.10%，生防菌处理组对西瓜枯萎病的防治效果达83.14%，显著高于三环唑处理组和维线克的18.09%和25.53%（P 0.01）。表3 生防菌NH-BS-2000，三环唑和维线克对西瓜成株期枯萎病的防治效果Table 3 Control efficacy (%) of NH-BS-2000, Tricyclazole and Weixianke against wilt disease of watermelon plants处理病征严重程度（株）总株数（n）病煮数（n）发病率（%）校正防效（%）0级1级2级3级生防菌NH-BS-200062622751013.33c8

21、3.14三环唑2528810714664.79b18.09维线克3020149734358.90b25.53对照1433128675379.10a-*表示在同一栏内，带相同字母的数字在Duncans新复极差测验的多重比较P 0.01时没有显著差异2.2.2 对西瓜植株的促长作用试验结果见表4。在处理后30d，生防菌NH-BS-2000处理的西瓜植株在株高、叶片数、着花数、座果数、叶长和叶宽等都高于清水对照，而且在着果数上表现出显著性差异（P 0.01）。三环唑处理在促长作用上与清水对照没有表现出显著性差异（P 0.01）；而维线克处理在对植株生长方面与对照没有显著差别，但是在着果数上要显著地低

22、于其它两种处理和清水对照（P 0.01）。表4 生防菌NH-BS-2000，三环唑和维线克对西瓜植株的促长作用Table 4 Promoting effects of NH-BS-2000, Tricyclazole and Weixianke on growth of watermelon plants处理株高（cm）叶片数（片）着花数（个）座果数（个）叶长（cm）叶宽（cm）生防菌NH-BS-2000187.7ab19.3ab9.3a3.5a15.5a13.9a三环唑181.0ab21.0a8.3a1.7b16.8a15.7a维线克109.3b14.0b7.3a0.3c15.6a13.8a

23、对照180.7ab18.7ab7.3a2.0b14.8a13.5a*表示在同一栏内，带相同字母的数字在Duncans新复极差测验的多重比较P 0.01时没有显著差异3 讨论目前，利用微生物及其代谢产物等生物农药进行瓜类枯萎病的防治，使用对人体和生态环境无害的生防菌剂替代化学农药已成为世界范围内的发展方向11-13。李晶等（2006）年报道用通过35亿活芽孢枯草芽孢杆菌B29水剂以浸种、灌根并用的方式防治西瓜枯萎病，田间试验结果表明：枯草芽孢杆菌水剂250倍液、500倍液对西瓜枯萎病具有明显的防治效果，而且还对西瓜植株具有一定的促进生长作用14。马艳等（2006）报道了对从西瓜植株体内分离得到的

24、内生拮抗枯草芽孢杆菌BS21菌对西瓜枯萎病有显著防效；BS21l菌能在辣椒等多种作物体内定殖，有较强的宿主适应性5。纪明山等（2002）年报道用绿色木霉TR-8菌株和芽孢杆菌1367菌株发酵物混合后制备成健根宝粉剂以1:50拌土在播种时穴施，对西瓜枯萎病的防效达80以上，显著高于常用药剂多菌灵和施特灵。此外，健根宝粉剂还对西瓜植株具有一定的促进生长作用15。前期的研究已表明本研究中所采用的枯草芽孢杆菌NH-BS-2000对西瓜枯萎病原菌也具有强烈的抑制作用，用生防菌NH-BS-2000处理病原菌8 d后。抑制率均在62.0%以上，最高抑制率达80.6，而且抑制作用的持续性强9。本试验表明生防菌

25、NH-BS-2000对西瓜苗期枯萎病的防治效果可达61.62%，高于化学药剂三环唑和维线克41.65%和37.55%，表现在能促进植株根部的生长。在处理30 d后，生防菌处理组对西瓜枯萎病的防治效果达83.14%，显著高于三环唑处理组和维线克的18.09%和25.53%，表明生防菌比化学农药具有更长的持效期，同时还能促进西瓜植株的株高、叶片数、着花数、着果数、叶长和叶宽等的生长。说明NH-BS-2000菌株具备作为枯萎病生防菌的良好优势，有望开发出瓜类枯萎病的生防菌剂。研究还发现生防菌NH-BS-2000的施用影响了土壤根际的微生物群落，显著提高了放线菌含量。袁虹霞等（1998）通过土壤微生物

26、-棉枯萎病菌平板对峙培养，从棉株根围土壤中筛选出抑菌效果较好的6个菌株，其中4个为放线菌，再通过田间小区防效试验，表明这4个放线菌的防效在60.5%-65.1%之间16。杨宇等（2006）报道筛到4株放线菌菌株，在田间可有效地控制黄瓜苗期枯萎病，其中65号菌株防效最好，其发酵液10倍液和50倍液的防效分别达91.8%和91.4%17。本试验发现生防菌NH-BS-2000处理后的健康植株根际土壤的放线菌含量显著地高于病株的含量，放线菌是对病原真菌具有一定抗性的微生物类群18，所以生防菌NH-BS-2000对西瓜根际微生物种群的调整作用可能是其具有较高防效的机制之一。参考文献：1 王芳，马建华，张

27、蓉，等.生物杀菌剂护根宝对西瓜枯萎病菌的抑制试验J.宁夏农林科技.2006(6)：40，114.2 张志忠，吕柳新，黄碧琦，等.西瓜枯萎病防治技术研究进展J.中国蔬菜，2005(7)：38-40.3 黎起秦，陈永宁西瓜枯萎病生防细菌的筛选J广西农业生物科学，2000，19（2）：81-844 Ozaktan H, Bora T. Biological control of Fusarium oxysporum f. sp. melonis by the formulations of fluorescent pseudomonadsJ. Journal of Turkish Phytopathology, 2000，29(2-3): 133-149.5 马艳，赵江涛，常志州，等.西瓜内生枯草芽孢杆菌BS211的拮抗活性及盆栽防效J.江苏农业学报，2006，22(4)：388-393.6 Dula B，Ap