PAGE,SDS-PAGE电泳分离.ppt

1、蛋白酶分离纯化技术,2005/2006,华南师范大学生命科学学院,第七节 电泳分离,带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。,电泳方法各式各样，使用的支持物(体)的不同，可以分为,纸电泳,薄层电泳 (硅胶G薄层),薄膜电泳 (醋酸纤微素薄膜),凝胶电泳,等电聚焦电泳,一 电泳的基本原理,不同的蛋白酶的带电性质（带电量和带何种电荷），大小和形状不同，在一定的电场下，它们的移动方向和移动速度也不同，从而得到分离。,可分离不同的蛋白酶 (制备性电泳), 分析其蛋白性质如分子量和等电点等(分析性电泳), 移动方向,颗粒在电场中的移动方向，决定于它们所带电荷的种类,带正电荷的颗

2、粒向电场的负极移动,带负电荷的颗粒则向电场的正极移动,净电荷为零的颗粒在电场中不移动, 移动速度,在电场中，颗粒的泳(移)动速度通常用迁移率来表示。 迁移率是指带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度,在电场中的泳动速度主要决定于, 颗粒（蛋白酶）本身所带的净电荷量,净电荷量越多,泳动速度越快, 颗粒（蛋白酶）的大小,分子量越小,泳动速度越快, 颗粒（蛋白酶）的形状,球型较快,泳动速度越快, 电场强度,越大,泳动速度越快, 溶液pH值,溶液pH值决定了溶液中蛋白酶的带电的性质如带何种电荷个带电的多少, 离子强度,溶液的离子强度越高，颗粒的泳动速度则越慢。反之则越快。一般电泳溶液的离子强度为0.02-

3、0.2, 电渗,在电场中，液体对于固体支持物的相对移动称为电渗,在毛细管电泳中，毛细管是由石英为材料，含硅酸成分，带负电荷，使毛细管中溶液感应而带正电荷。水分子便向负极移动，并带动溶液中的蛋白酶等颗粒一起向负极移动, 若蛋白酶带负电，泳动速度则变慢,一般要选择电渗较少的固体支持物(不带电),若带正电，泳动速度则加快,若不带电，颗粒也会向负极移动,二，电泳技术的应用范围, 酶的纯度鉴定（分析电泳）,SDS-PAGE、PAGE、IEF（电泳纯）, 酶全酶和亚基分子量测定,SDS-PAGE、PAGE, pI测定,IEF, 酶的分离纯化（制备电泳）,三，主要采用的电泳技术(支持物), 聚丙烯酰胺凝胶电

4、泳,同时具有电荷和分子筛的双重作用，故具很高的分辨率, Native-PAGE- 蛋白在天然状态下的电泳, SDS-PAGE- 蛋白在SDS变性下的电泳, 琼脂糖凝胶电泳(核酸电泳),琼脂糖凝胶为电泳的支持物. 方便但分辨率低, 醋酸纤维素薄膜电泳, 聚丙烯酰胺凝胶的形成,丙烯酰胺和甲叉双聚丙烯酰胺为聚合单体,在聚合催化剂的催化下,聚合为聚丙烯酰胺凝胶,聚合的催化剂,过硫酸铵和四甲基乙二胺(TEMED),光和化学核黄素,四 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE), 丙烯酰胺 甲叉双丙烯酰胺,有毒，液体,无毒，固体.,聚合,聚丙烯酰胺凝胶,催化剂,聚合单体丙烯酰胺的浓度和凝胶孔径的关系,均一胶和梯度胶,

5、聚丙烯酰胺凝胶通常由浓缩胶和分离胶组成,浓缩胶:丙烯酰胺浓度均为4%,起蛋白上样和浓缩的作用,分离胶:起分离蛋白的作用, 丙烯酰胺浓度可以是相同的(均一胶),也可以是不同的(梯度胶),梯度胶电泳的特点,分离胶的丙烯酰胺浓度由上至下形成从低到高的连续梯度,一般是4%-20%,分辨率高,可连续上样,电泳时间长,可消除电荷对迁移率的影响,浓度梯度凝胶的配制,需采用梯度混合器，配制时，浓溶液置于混合室，稀溶液置于贮存室,碱性电泳系统,用pH8.3的电泳缓冲液，电泳向正极进行.下槽接正极，上槽接负极，以溴酚蓝为指示染料,最常用,可用于分析绝大多数的蛋白酶，因为其pI8.3，即蛋白酶带负电,酸性电泳系统,

6、采用pH4.0左右的电泳缓冲液，电泳向负极进行.下槽接负极，上槽接正极，以亚甲基绿作指示染料,适用于分析酸性和碱性蛋白，即pI4.0的蛋白均适用, PAGE的用途,分析蛋白酶的纯度,蛋白泳动与蛋白大小，电荷和形状有关，凝胶兼有分子筛的功能,电泳的分辨率很高，可以把不同的蛋白酶分开,一条带表明纯度高（电泳纯）,蛋白酶在电场中的泳动速度决定于：,蛋白酶的净电荷量,蛋白酶形状和大小（全酶分子量）,分析蛋白酶的全酶分子量,电场强度,溶液pH值,离子强度,电渗,全酶分子量的对数(Log Mr)和泳动距离成反比, PAGE的局限性,如果蛋白和杂蛋白的pI相差很大，也要注意有些杂蛋白容易被忽视，因为两者泳动

7、方向不同,蛋白和电泳缓冲液的pH相同，蛋白不会泳动,如果蛋白酶不同的多聚态并存，纯度高但也可能呈2-3条带,电泳和其它方法如HPLC（高压液相色谱）结合起来，判断蛋白酶的纯度会更可靠!,五 SDS-PAGE,在十二烷基硫酸钠(SDS) 存在的条件下所作的聚丙烯酰胺凝胶电泳,称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称SDS-PAGE,巯基乙醇使蛋自中的二硫键还原,1g蛋白和1.4g SDS结合形成蛋白-SDS胶束。SDS带大量的负电荷,SDS破坏蛋白质的非共价键, SDS-PAGE的原理,各种蛋白-SDS胶束均带负电,且电荷量相近,电泳迁泳率只取决于胶束(亚基Mr)大小,使含有亚基的蛋白质解离为各个亚

8、基,蛋白-SDS胶束长轴的长度和蛋白亚基Mr成正比,蛋白-SDS胶束在水溶液中都成椭圆形，其短轴长度都为18A左右, SDS与蛋白结合，并引起蛋自构象的变化,测定蛋白亚基Mr,研究蛋白纯度,可结合PAGE 、HPLC、IEF等,SDS-PAGE的主要用途,研究蛋亚基组成,分辨率高(如果是梯度胶),方便易行,是蛋白组学研究的核心技术,SDSPAGE的优点,精确度高(测定误差不超过10%),SDSPAGE中蛋白亚基Mr与电泳迁移率的关系,SDS负电荷量远高于蛋白的电荷量，不同蛋白之间的蛋白-SDS胶束的电荷是近似的,蛋白-SDS胶束均为椭圆形,蛋白之间的胶束的分子形状是近似的, 蛋白亚基Mr的对数

9、电泳迁移率成反比 Log Mr- 电泳迁移率,蛋白-SDS胶束中蛋白/SDS比例并非都是 1:1.4,同一蛋白能以不同的比例和SDS结合,蛋白-SDS胶束甚至可以带负电荷,SDSPAGE的缺点,蛋白-SDS胶束中蛋白电荷量并非都可以忽视,空间位阻妨碍蛋白和SDS的充分结合,糖蛋白:糖蛋白的糖基会形成空间位阻,亚基Mr的对数与其电泳迁泳率不成线性关系,蛋白受体:二硫键丰富,不容易彻底解离为亚基,所测亚基Mr会偏高,胶束中蛋白/SDS的比例并非都是 1:1.4,含辅酶的复合蛋白，多酶复合体等:其亚基Mr可能测不准,碱性组蛋白和酸性铁氧还蛋白在SDS-PAGE所测亚基Mr偏高,组蛋白亚基Mr为21k

10、D，但测定出为35kD,组蛋白的正电荷抵消了SDS部分负电荷,胶束中蛋白电荷量不能忽视,铁氧还蛋白的亚基Mr只有8kD，但Rf=0.8,铁氧还蛋白不能和SDS充分结合,强碱性的精蛋白在SDS-PAGE中会沉淀,可能是精蛋白的正电荷和SDS的负电荷相差无几,磷酸化前后的蛋白激酶能以不同的比例和SDS结合,其构象会发生改变，妨碍了蛋白和SDS的结合,SDS-PAGE中所测亚基Mr会偏高,同一蛋白能以不同的比例和SDS结合,经磷酸化后，会使激酶的负电荷增加，,同一钙调蛋白可以不同比例和SDS结合,不同Ca2+浓度下的钙调蛋白的电泳行为 SDS-PAGE中的蛋白大小 无Ca2+ 20kD Ca2+处于

11、饱和状态 12kD Ca2+处于亚饱和状态 在20-12kD之间有多条带, 不同Ca2+浓度下的钙调蛋白的疏水性质不同, 疏水性质不同导致和SDS结合的比例不同, 导致钙调蛋白有不同的大小,铁氧还蛋白和钙调蛋白是酸性蛋白，无论是否和SDS结合和结合程度如何，在碱性电泳系统的SDS-PAGE中均向负极泳动，只是迁移率不同而已,蛋白-SDS胶束可以带正电荷,如果碱性蛋白和SDS结合率很低，达不到1:1.4,它就可能向负极泳动。,碱性蛋白能充分和SDS结合，但其所带正电荷比SDS负电荷还要多，使蛋白-SDS胶束带正电，同样会向负极泳动,植物绿叶粗蛋白中含大量负极泳动的蛋白,菜心绿叶粗蛋白经SDS-醋

12、酸纤维素薄膜电泳,下方为正极,箭头处为蛋白样品点样的位置,正极,负极,植物绿叶粗蛋白中含有向负极泳动的蛋白,菜心(A)和生菜(B)绿叶粗蛋白经SDS-醋酸纤维素薄膜电泳,下方为正极,箭头处为蛋白样品点样的位置,正极,负极,A,B,植物绿叶粗蛋白中向负极泳动的蛋白的氨基酸组成,Table Amino acid contents of cathode buffer after crude protein from B. campestris ssp. chinensis var. utillis leaves was subjected to SDS-PAGE Amino acid Content

13、 ( %) Amino acid Content ( %) Asp 2.03 Thr 1.32 Ser 4.11 Glu 3.02 Gly 4.56 Ala 2.09 Cys - Val 5.19 Met - IIe 1.13 Leu 1.97 Tyr 2.16 Phe 57.05 Lys 10.15 His 1.01 Arg 4.21 Pro - Trp -,见:梁秀文等.植物绿叶粗蛋白在SDS-PAGE中向负极泳动的富含苯丙氨酸的碱性蛋白的测定. 热带亚热带植物学报,2006,14（2）：126-129,植物绿叶乙醇酸氧化酶含有向负极泳动的蛋白,Fig.SDS-denatured glyc

14、olate oxidase from B. campestris ssp. chinensis var. utillis leaves was subjected to SDS-PAGE (A), CE (B) and acetate cellulose membrane electrophoresis (C). The polarity was shown and the arrow indicates the original of protein sample,植物绿叶乙醇酸氧化酶中向负极泳动的蛋白的氨基酸组成,Table Amino acid contents of cathode b

15、uffer after partially purified glycolate oxidase from B. campestris ssp. chinensis var. utillis leaves was subjected to SDS-PAGE Amino acid Content ( %) Amino acid Content ( %) Asp 3.14 3.08 4.19 Thr 1.48 1.64 2.15 Ser 4.11 5.38 4.87 Glu 5.54 2.82 4.31 Gly 5.54 4.27 4.25 Ala 1.98 1.77 1.25 Cys - - -

16、 Val 7.49 1.38 1.76 Met - - - IIe 2.32 1.64 0.92 Leu 2.89 2.89 1.66 Tyr 1.48 1.90 2.10 Phe 60.00 65.62 62.30 Lys 10.15 6.17 3.06 His - - - 1.53 Arg 2.53 1.44 3.00,见:曾秋莲等. 植物中在SDS-PAGE中向负极泳动的富含苯丙氨酸的蛋白的发现. 中国生物化学与分子生物学报, 2006, 22(1):86-90,发现蛋白-SDS胶束向负极泳动的意义,蛋白性质和蛋白组学研究有缺陷,负极泳动的蛋白容易被忽视,解释有些蛋白的电荷不均一性,很多

17、蛋白经一些方法证实是纯的，如SDS-PAGE后只有单带，但IEF却含多个pI。目前对其中的原因众说纷纭，尚无公认的解释，有人认为是空间构象不同所引起，但未有确切的证据。,猪生长激素经SDS- PAGE后只有28kD带，IEF却有6.0-7.2等五个pI。,猪生长激素可能含两种不同的亚基，其中28kD是个普通蛋白；而另一个亚基则在SDS -PAGE中是向负极泳动，因而被忽视,蛋白-SDS胶束向负极泳动的机理,蛋白/SDS胶束带正电,蛋白是个碱性蛋白,碱性蛋白的正电荷比SDS的负电荷还要多,碱性蛋白/SDS的结合比例远低于1:1.4,六 等电聚焦电泳,等电聚焦电泳简称为等电聚焦。是在1966年成功

18、地合成载体两性电解质以后才发展起来的电泳技术,在电泳系统中加入两性电解质载体，通电后，载体两性电解质即在电场中形成一个由负极到正极连续变化的pH梯度,当蛋白质,酶或多肽进入这个pH梯度时，不同的蛋白质会不断地泳动,直至到达(聚焦)与其pI相当的pH位置上,用于分离具有不同pI的蛋白和测定蛋白的pI,等电聚焦电泳的特点,浓缩效应(或称聚焦效应), 分离仅仅决定于蛋白质的pI。电泳中区带越来越窄，克服了其他电泳中存在的扩散作用。, 一旦蛋白质到达它的等电点位置，它就没有净电荷，蛋白质只能在它的等电点位置被聚焦成一条窄而稳定的带,与样品加样位置无关,不管样品加在什么部位，都可以聚焦到与其等电点相当的pH的位置,很稀的样品都可分离，而且重现性好, 分辨率高,可将pI仅相差0.01-0.02pH单位的蛋白质分开,等电聚焦电泳的载体-两性电解质,用IEF离蛋白质，必须要有一个稳定的和线性的pH梯度,早期发现谷氨酸，组氨酸或赖氨酸能产生大约1pH的梯度,但pH范围太窄，且缓冲能力不够,