chapter2细胞分离与破碎1.ppt

1、第二章 细胞分离与破碎6,固液分离的类型,1、过滤(重力过滤器、压滤器、真空过滤器) 2、离心 3、重力沉降,发酵液的组成,悬浮液： 指固体颗粒在0.1m以上的固液分散体系。生物细胞培养液基本上也是悬浮液。 培养液的组成： 水70-80% + 固体细胞及碎片20-30%(对微生物发酵)+ 少量的代谢成物 + 细胞破裂后的内容物 + 残存的培养基成分,培养液的基本特征,A、细胞成分及碎片大小不一，颗粒大小，分离成本。 B、固液密度相近，黏度高：沉降和离心分离困难 C、固体成分可压缩可变形 + 高黏度：过滤困难，黏附在滤布，错流过滤形成凝胶层 D、动植物细胞抗剪切力差：错流膜过滤和离心等不适 E、

2、流变性复杂，非牛顿型流体，青霉素发酵液为卡森型流体，120h链霉素发酵液为拟塑性流体，灰色链丝菌发酵液为塑性流体。,备注,在高分子液体范畴内，可以粗略地把非牛顿型流体分为： 纯粘性流体，但流动中粘度会发生变化，如某些涂料、油漆、食品等。 粘弹性流体，大多数高分子熔体、高分子溶液是典型的粘弹性流体，而且是非线性粘弹性流体。一些生物材料，如细胞液，蛋清等也同属此类。 流动性质有时间依赖性的流体。如触变性流体，震凝性流体。,对微小而形状多变的微生物细胞，发酵液和其它生物溶液的固液分离就变得复杂了 。 一般，由于料液通常都是高的非牛顿粘度流体或者是高度可压缩滤饼，发酵液和其它生物溶液是极其难以过滤的，

3、因此，必须对这些生物分离程序进行修改。,预处理,预处理的目的: 改变发酵液的物理性质 (黏度、颗粒大小、颗粒稳定性等)，固液分离速度，分离器分离效率； 目标产物转移其中一相(多数为液相)；,1、 加热,最简单、最经济的预处理方法是加热，加热不仅可以增加料液的操作特性，也可以对其进行灭菌。但加热变性的方法只适合于对热稳定性的产物。 加热可产生： 黏度、促凝聚、固体成分体积、破坏凝胶结构、增加空隙率、去蛋白,2、调pH值：方法简单有效、成本低廉 pH直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，适当调节pH可改善其过滤特性。 对于氨基酸、蛋白质等两性物质作为杂质存在于液体中时，常采用调pH至等电点使

4、两性物质沉淀。 另外，在膜分离中，发酵液中的大分子物质易与膜发生吸附，常通过调整pH，改变易吸附分子的电荷性质，以减少吸附造成的堵塞和污染。 此外，细胞、细胞碎片及某些胶体物质等在某个pH下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒，有利于固液分离。,3、凝聚和絮凝,通过电解质的加入促进原始溶液的凝聚和絮凝 主要作用为增大混合液中悬浮粒子的体积，提高固液分离速度，同时可除去一些杂质。,凝聚和絮凝是两种方法，两个概念。 凝聚：指在投加的化学物质（铝、铁的盐类或石灰等）作用下，胶体脱稳并使粒子相互聚集成mm 大小块状凝聚体的过程。 絮凝：指使用絮凝剂（天然的和合成的大分子量聚电解质）将胶体粒子交联成网，形成10

5、mm大小絮凝团的过程。其中絮凝剂主要起架桥作用。,凝聚：胶体粒子(10-100nm)中性盐促进下脱稳相互聚集成大粒子（1mm） 机理：a 中和粒子表面电荷 b 消除双电层结构 絮凝：大分子聚电解质将胶体粒子交联成网状，形成絮凝团的过程 机理：架桥作用,凝聚和絮凝技术能有效的改变细胞菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态,使其聚集起来,增大体积以便固液分离,常用于菌体细小而且黏度大的发酵液的预处理中.,发酵液的带电现象,发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子的表面，一般都带有电荷，带电的原因很多，主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。通常发酵液中细胞或菌体带有负电荷，由于静电引力的作用使溶液中带相反

6、电荷的粒于（即正离子）被吸附在其周围，在界面上形成了双电层。,凝聚剂种类： A、无机盐类：如硫酸铝、明矾、硫酸铁、硫酸亚铁、FeCl3、AlCl3、ZnCl2、硫酸镁等； B、无机碱：如Al(OH)3、Fe(OH)3、Ca(OH)2、CaO等； C、聚合无机盐，如聚合铝、聚合铁。 机理：A、破坏双电层，B、水解后胶体吸附，C、氢键结合等。,絮凝剂种类： A、阳离子类，如聚丙烯酰胺(+)、聚苯烯酸二烷基胺乙酯、聚二烯丙基四胺； B、阴离子类，如聚丙烯酸纳、聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酰胺(-)； C、非离子类，如聚丙烯酰胺(0)、环氧化乙烯。 机理： 絮凝剂主要起中和电荷、桥架和网络作用,一种颗粒均匀、

7、质地坚硬的粒状物质，用于扩大过滤表面的适应范围，减轻细小颗粒的快速挤压变形和过滤介质的堵塞。 使用方法：A、预涂层；B、按一定比率混合。 助滤剂种类：硅藻土、膨胀珍珠岩、石棉、纤维素、未活化的炭、炉渣、重质碳酸钙，及它们的混合物等。 用量标准：A、单位质量助滤剂所产生的最大滤液产量(最常用)；B、或最长周期；C、或最快流速；D、或滤饼的最大空间利用度。,4、惰性助滤剂：,0,0,200,400,600,6,12,18,pH 4.6,pH 4.2,pH 3.8,pH 2.8,Filtrate Volume, cm,3,Time,minutes,Fig2.1 The effect on filtr

8、ate volume of pH and filter aid,图2.1 pH值与助滤剂对过滤体积的影响,(b)Effect of filter aid,1% filter aid in feed,2%,3%,5%,Time,minutes,0,0,100,400,600,6,12,18,Filtrate Volume,cm,3,Fig2.1 The effect on filtrate volume of pH and filter aid,图2.1 pH值与助滤剂对过滤体积的影响（续）,有时加入某些不影响目的产物的反应剂，可消除发酵液中某些杂质对过滤的影响，从而提高过滤速率。 加入反应剂和

9、某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀，如CaSO4 、磷酸铝 等。生成的沉淀能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构，沉淀本身可作为助滤剂，并且能使胶状物和悬浮物凝固，从而改善过滤性能。,5加入反应剂,例子： 在新生霉素发酵液中加入氯化钙和磷酸钠，生成磷酸钙沉淀可充当助滤剂，另一方面可使某些蛋白质凝固。 环丝氨酸发酵液用氧化钙和磷酸处理，生成磷酸钙沉淀，能使悬浮物凝固，多余的磷酸根离子还能除去钙、镁离子，并且在发酵液中不会引入其它阳离子，以免影响环丝氨酸的离子交换吸附。,发酵液的相对纯化,1.无机离子的去除 Ca2+ 、Mg2+ 、Fe2+等 Ca2+离子浓度较高时，可采用可溶性盐，如草酸钠等 M

10、g2+离子的去除一般采用加入三聚磷酸钠 磷酸盐处理，也能大大降低Ca2+ 、Mg2+离子的浓度 铁离子，可加入黄血盐，使其形成普鲁士蓝沉淀而除去,利用各种沉淀方法，可以去除液相中各种蛋白质。常用的有等电点沉淀法、变性沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法、反应沉淀法等。这些沉淀方法既可以作为除杂质的方法，也可以作为提取目标产物的技术手段。,2杂蛋白的去除,酶解法可将混合液中的不溶性多糖物质酶解，使其转化为溶解度较大的单糖，从而改变流体的流动特性，提高过滤速率。 例如：万古霉素用淀粉作培养基，发酵完成后，发酵液中多余的淀粉使混合液粘度较大，当加入0.025的淀粉酶后，搅拌30min，再加2.5助滤剂（硅

11、藻土），可使过滤速率提高5倍。,3多糖的去除,发酵液中有色物质可能是由于微生物生长代谢过程分泌的，也可能是培养基（如糖蜜、玉米浆等）带来的，色素物质化学性质的多样性增加了脱色的难度。 色素物质的去除，一般以使用离子交换树脂、离子交换纤维、活性炭等材料的吸附法来脱色最为普遍。例如活性炭可用于柠檬酸发酵液的脱色，盐型强碱性阴离子交换树脂可用于解朊酶和果胶酶溶液的脱色，磷酸型阴离子交换树脂被用于谷氨酸发酵液的脱色等。一般发酵液的脱色往往是在过滤除去菌体后进行。,4有色物质的去除,2.1 细胞分离,The first step in most industrial bioseparations is

12、the removal of insoluble solids from the fermentation beer. The concentration and size of these insolubles varies widely. 大部分工业生物分离的第一步往往是将不溶物质从发酵液中除去。这些不溶性固体的浓度和颗粒大小的变化范围很宽。 The concentration can be as high as 60% per volume or as low as 0.1%. 浓度可高达每单位体积含60%的不溶性固体，又可低至每单位体积仅含0.1%。,The size ranges f

13、rom microorganisms of perhaps 1 um diameter up to insoluble nutrients characteristically 1mm in diameter 粒径的变化可以从直径约为1um的微生物，到直径为1mm的不溶性物质。 When these insolubles are dilute, large B、低固体含量的悬浮液(1%),Tubular bowl,管式离心机,沉降计算 粒子在Z-axis 上的移动速度： 粒子在r-axis 上的移动速度: 粒子的运动轨迹：,g= d2(s-)g/(18) (2.6),s= d2(s-)r2/(

14、18) (2.16),（2.21）,管式离心机,管式离心机,清除条件：最难分离的粒子在入口：Z=0，r=R1; 在出口：Z=H, r =R0。按进入和离开的边界条件，将上式积分得： 在大多数条件下，由于液层很薄，R0 Rl，上式可简化为： 意义：A、最大流量Qmax与离心机特征(H, R0, Rl, )的关系，超过最大流量，粒子不能被清除； B、离心机设计、放大和操作的基础。,多室离心机(管式离心机的变形),操作： 应用：A、抗生素的液-液萃取分离， B、固相浓度小于的固液分离，如酒类和果汁的澄清。 主要技术参数：A、3-7个分离室，B、分离因子2000-8000g，C、处理能力2.5-10

15、m3/h，D、颗粒d 0.1m，E、固体浓度。 优点(与管式比较)：A、加强功能：分离液流程、沉降面积、流层减薄、沉降距离减小； B、颗粒的筛分作用：粗颗粒沉降到内层分离室，细颗粒沉降到外层分离室. 缺点：沉淀清理困难。,碟式离心机,化学、制药和生化工业应用最广泛 特点： A、10-100个锥顶角为60-100的锥形碟片； B、碟片距很短0.5-2.5mm，沉降距离极短，分离效果高； C、碟片多，沉降面积大，增加分离效果； D、抗对流效果高。 分类： 、人工排渣式; 、喷嘴排渣式; C、活塞排渣式。,人工排渣碟片离心机,操作： 应用：A、液-液分离，并含少量固体， B、固-液分离，固相含量小于

16、%， C、澄清操作。 主要技术指标：A、分离因子10000g以上；B、适应的颗粒直径0.0220m，固体含量小于%，C、 100t/h。 优点：A、分离因子达10000g以上， B、特别适合于含少量细颗粒的液液分离。 缺点：A、转鼓与碟片之间空隙大，不易发挥离心机的高效分离性能； B、停车清洗，生产效率低，劳动强度大。,喷嘴排渣碟片离心机,操作： 应用：多用于cell浓缩，浓缩比在5-20。 主要技术指标：A、分离因子5000g左右；B、适应的颗粒直径0.1-100m，固体含量25%，C、喷嘴2-24个，D、转鼓d 900mm 优点：A、颗粒富积好，B、处理量大，可达300t/h。 缺点：A、

17、分离因子5000g，低，不适合于小颗粒的分离；B、富积的颗粒含水量大。,活塞排渣碟片离心机,操作： 应用：多种颗粒的分离(0.1-500m颗粒)，固体含量10%)。,4.6碟式离心机,最大流量计算,螺旋卸料沉降离心,操作：立式，卧式 应用：A、高浓度的大颗粒的固液分离(达50%, 2um-5mm)，如淀粉精制和污水处理。 主要技术指标：A、分离因子小于6000g；B、适应的颗粒直径2um-5mm，固体含量1-50%，C、固液密度差0.05g/cm3，D、转鼓直径-900mm。 优点：A、操作温度高300C大；B、处理量大，可达60t/h。 缺点：分离因子小于6000g，不适合于小颗粒的分离。,

18、螺旋卸料沉降离心机,沉降计算：,离心过滤,原理:,离心过滤,计算 流量方程： 注：流量为非常数，时间增加， 滤饼厚度增加，而流量减小。 滤饼形成时间方程： 意义：得到滤饼厚度(R0-RC)所需时间，用于工艺放大 Q,4.9离心设备的选择,基本参数 选择 颗粒d,固液差, 基本型号 固体物浓度 亚型 产物热稳定性 低温离心 流量Q, 规模 规格、台数 气溶胶,活cell 密封灭菌设计,离心机的放大可采用等校正系数法：,超速离心技术,超速离心机：分离因子在100,000g以上的离心设备,超速离心技术1,操 作 模 式,超速离心技术-应用,A. 测定分子量: B. 大分子的纯度鉴定 C. 大分子的构

19、相变化 D. DNA半保留复制,超速离心-DNA半保留复制,2.1.3 过滤（Filtration）,概念 过滤是在外力作用下，利用过滤介质使悬浮液中的液体通过，而固体颗粒被截留在介质上，从而实现固液分离的一种单元操作。过滤介质具有多孔结构，可以截留固体物质，而让液体通过；我们把待过滤的悬浮液成为滤浆（Slurry），而过滤后分离出的固体称为滤渣或滤饼（Filter cake），通过过滤介质的液体称为滤液（Filtrate）。 （1）过滤介质（Filter medium）： 过滤介质应具有以下特性：多孔性，足够的机械强度，尽可能小的流动阻力，耐腐蚀性，耐热性，易于再生。 工业上常见的过滤介质：

20、织物介质、堆积介质、多孔固体介质、多孔膜。,（2）过滤分类： 深层过滤（Deep bed filteration） 滤饼过滤（Cake filteration）,（3）过滤推动力： 重力（漏斗过滤）、压力（加压过滤）或真空（抽滤）、离心力（离心过滤）。 （4）滤饼的可压缩性 （5）助滤剂 助滤剂本身就是一性能良好的过滤介质，是一种坚硬、不规则的小颗粒，它能形成结构疏松、空隙率大、不可压缩的滤饼，很大程度改善过滤难度。助滤剂使用方法主要有两种：混合、预涂。,滤饼,传统的过滤,2.1.3.1 过滤速度,过滤过程数学描述 达西方程： 1、适用于不可压缩和简单的可压缩滤饼 2、普遍使用于生物分离过程,

21、过滤基础理论,Darcy定理 U = 流体的速度(in: m/s)，p = 压力差(in: Pa)，l = 床层厚度(in: m)，K = Darcys 渗透系数，与流体和床层的性质有关。,过滤理论基础,Kozenys 方程 对于发酵液的过滤,要用Kozenys方程 K = Kozenys 常数，一般K = 5（在大量均匀的球形颗粒中），其他颗粒K = 3.5-5.5，颗粒，K；S = 单位体积颗粒中颗粒的表面积； = 发酵液黏度(in: Pa s)； = 床层的空隙率，即空隙体积与总体积的比值。 方程适应条件：A、薄层区域表面的流速，B、非常高的孔隙率，C、非常广的颗粒尺寸的分布，D、纤维状

22、的、可压缩的和吸湿性的填充物。 意义：过滤的基础方程，揭示了过滤流速与各因素的关系,2.1.3.1 过滤速度,滤饼阻力与滤饼干重之间的关系, 为滤饼的平均比阻，不可压缩性滤饼的为常数，可压缩性滤饼的为压差的函数，经验表达式为：,过滤基础理论,比阻(平均质量比阻 m/kg)定义式 s：干滤饼的密度(in kg/m-3)。 意义：A、反映过滤的难易程度，越大，越困难；B、与颗粒大小、孔隙率等的关系。 n滤饼可压缩度，当滤饼不可压缩时，n = 0；对于高度可压缩滤饼，则n 1。 = 湿滤饼的质量：干滤饼的质量。 意义：,S = 单位体积颗粒中颗粒的表面积,过滤基础理论,意义：A、对于可压缩料液，高压

23、不一定增加流量 。,B、比阻与压力的关系,随着过滤操作的进行，滤饼量不断增加，与滤液体积Q之间关系如下：,=湿滤饼/干滤饼；cs=干滤饼/液料 cs=湿滤饼/液料；1- cs= 滤液/液料；Q滤液体积 Q/（ 1- cs）= 液料体积 LQ/ （ 1- cs）= 液料质量,过滤基础理论,Ruths 方程 在过滤操作中，被截留的固相颗粒在介质形成滤饼。过滤的阻力来自过滤介质和滤饼。过滤流量可表达为 Q：滤液体积(in m3)，A：过滤面积(in m2)， 湿滤饼:干滤饼，cs：料液中干固相成分的浓度(in: kg/kg)，：滤液密度，Q0：相当于过滤介质阻力时的虚拟滤液体积(in m3)，一定过

24、滤介质的Q0为常数。 意义：过滤的流量方程,过滤基础理论,恒压过滤方程(最常用模式) 恒压条件下对Ruths方程积分 t0：为透过虚拟体积所要的虚拟时间。在一般条件下Q0可忽略，上式为 意义：中试后放大的理论依据 恒速过滤 恒速条件下对Ruths方程积分,过滤设备从传统的板框式过滤机到旋转式真空过滤设备，种类很多。,2.1.3.2 过滤设备,常用新型过滤器,转鼓真空过滤器 操作： 应用：大规模生物分离的主要过滤设备，用于较难分离的低黏度发酵液 优点：、大规模，、自动化、操作简单，、滤布装卸容易、易保养维护。 缺点：、占地大，单位体积利用率低，、周期性中断进料、滤布利用率低，、压力低，仅应用于低

25、黏度发酵。,常用新型过滤器,圆盘真空过滤器 操作 应用：同上。 优点：、超大规模(400 m2)，极易实行大型化分离，、占地小，单位体积利用率高，、自动化、操作简单。 缺点：、压力低，仅应用于低黏度发酵液，B、设备投资高。,常用新型过滤器,带式真空过滤器,常用新型过滤器,应用：大规模分离的主要过滤设备，可分离较难分离的低黏度的发酵液，对滤饼洗涤要求高。 优点：)、发酵液处理量大，滤饼厚达200mm， )、滤饼洗涤容易，效果好，无须搅拌， )、自动化、操作简单，清洗保养容易。 缺点：)、占地大，有效过滤面积低， )、压力低，仅应用于低黏度发酵液， )、设备投资高。,常用新型过滤器,压力系列：带式、板框、加压、气压罐式压滤机,常用新型过滤器,应用：用于很难处理的、高黏度、高细颗粒含量的发酵液的固液分离。 优点：、操作压高.Mpa以上，的 颗粒含量，高含量的细颗粒， 、滤饼含水量低，滤液澄清， 、自动化、操作简单，清洗保养容易。 缺点：、占地大，有效过滤面积低， 、设备投资高，能耗高。,如何选择过滤器？,1、滤液的澄清度 2、颗粒大小的分布 3、发酵液的黏度 4、固体颗粒的浓度 5、滤饼的干燥度 6、滤饼的洗涤 7、生产能力,Filting medium,Type of Filter,Other requirements,中试实验设计的路线,1、确定生产能力（例：15