第7章 微生物的生长和遗传变异.ppt

1、第7章 微生物的生长和遗传变异,水处理微生物学,第一节 微生物的生长及其特性,第二节 微生物的遗传,本章的知识点：,第四节 遗传工程,第三节 微生物的变异,第五节 微生物的驯化与保藏,本章的重点：,本章的难点：,微生物在间歇培养中生长繁殖的一般规律和在废水处理等实际应用中的指导意义； 利用微生物的变异性改变微生物菌种性能及其在环境保护中的作用。,遗传工程在水污染控制中的应用,生长：个体增大； 繁殖：个体数量增多 生长细菌群体数量的增长，不是个体体积的增长。 提问：为什么这里不考察细菌个体的生长呢？ 个体太小，难观察计量 群体细菌对环境产生影响,第一节 微生物的生长及其特性,一、 细菌生长的测定

2、方法,（一）直接计数法 （二） 间接计数法(活菌计数法) （三） 重量法,细菌生长的测定方法,（一）直接计数法 借助显微镜观察测定,优点：快速 提问:有哪些缺点? 缺点：不能区分细菌的死活 分四种,1.涂片染色法,1视野菌液(ml)(0.01ml 1cm2)*视野面积(cm2),2.计数器(血球计数板）测定法,0.1ml菌液,3.比例计数法,比例样品菌液与等体积的血液混合，观测二者比例,提问：如果平均每个视野中细菌数量/红血球的数量比例为5.5：1，则细菌数量=？ 5.5400万个/m l =2.2107个/mL样品,红血球数已知(男性400500万个ml，女性350450万个ml)，平均40

3、0万个/ml,4比浊计数法,浊细菌悬浮液的浊度,提问：如何定量二者关系呢？,细菌不完全透光，一定范围内菌溶液的混浊度与菌数量成正比,（1）制标准曲线（ODNo）,（2）测菌液浊度，查图表得出细菌数量,浊度仪或721分光光度仪,（二）间接计数法(活菌计数法),提问：前述方法中计数的不都是活菌，如何分辨菌死活？ 繁殖 提问：细菌繁殖的可见现象是什么？ 产生菌落（固体培养基培养）、菌液混浊（液体培养基培养） 计数原理：一个细菌可繁殖成一个菌落 缺点：慢 分固体培养法和液体培养法,无菌水,1. 稀释平板计数法固体培养法,第一步：菌样巧妙稀释,得到不同稀释度 （10-x）菌液,菌样被无菌水不同稀释倍率后

4、平板培养图,各取1ml，均匀涂布于冷固体培养基平板上或与温热液态固体培养基混合冷却。,第三步：培养,稀释度过低，菌落密集无法计数,可以计数，但数量过多，费时费力,数量合适，统计计算，作为结果,数量太少，误差因素太大，不做计数,第二步：接种平板,每一个细菌会生成一个菌落,一般计数平板的细菌生长菌落数以30300个为宜。,第四步： 计数,细菌数量=？ 细菌数量=数出的菌落数/稀释度 例如：10-5稀释度时菌落数为125个 细菌数量=125/10-5=1.25107个/mL 平板计数法是采用最广的一种活菌计数法 如国标法水中细菌总数的测定 。 注意：作空白及取平行样（23组）均值减小误差,平均,(三

5、)重量法,提问：已知什么条件通过测定细菌群体重量知道其数量？ 已知单个细菌的平均重量 除法计算 细菌的湿重量10-1510-11g/个细胞 干重约为湿重的1020。 1. 干重法,方法：含菌水样在105110下进行干燥恒重 （测水中悬浮物重量MLSS或MLVSS）。,1、称重法 用离心或过滤的方法将菌体从培养基中分离、冼净，称湿重或干重。 优 点：简单可靠。在活性污泥法中采用的指标： （1）混合液悬浮固体(MLSS)（粗放测定） （2）挥发性悬浮固体(MLVSS)（相对准确）,2.细胞含N量法,大多数生物包括细菌，细胞内的蛋白质氮含量比较稳定，一般为蛋白质干重1516，平均为16。 还需要测定

6、哪些条件可以由以上比例确定菌样中细菌浓度？ 如何试验操作及计算呢？,3.DNA含量法,同种细菌的DNA含量一致,可通过测定DNA的含量来表示细菌的生长量,少量纯细菌培养时细菌数量的测定精确性非常高，对样品纯度以及仪器和人员的要求较高 。,二、微生物的生长特性,微生物在培养过程中生长变化的规律 间歇式培养 连续式培养 微生物的生长曲线 微生物重量随培养时间延续的曲线关系 微生物数量随培养时间延续的曲线关系来考察细菌的生长特性,（一）间歇培养和生长曲线,将少量单细胞微生物接种于一定量的液体培养基内，在适宜的条件下培养,在培养的过程中不加入也不取出培养基和微生物，叫做间歇培养（分批培养）。 细菌在新

7、的适宜的环境中生长、繁殖、衰老、死亡的动态变化。 定时取样测定活微生物数目的变化，用坐标法作图,以时间为横坐标,以细胞微生物数量的对数为纵坐标,可以绘出一条有规律的曲线,称为生长曲线。,间歇培养中微生物的生长曲线,迟缓期,衰亡期,稳定期,对数期,总菌数,活菌数,提问：为什么微生物数目用对数值作图？,微生物的数量很大，都是10的n次方，取对数作图时方便。,根据细菌生长繁殖速率将生长曲线分四个阶段：,间歇培养的微生物群体生长规律,缓慢期 对数期 稳定期 衰亡期,细胞数量法（缓慢、对数、稳定和衰亡期）,（1）缓慢期（停滞期）,当细菌被接种到新鲜培养基中，开始一段时间内，通常不立即进行细胞分裂、增殖，

8、生长速率近于零，细胞数目几乎保持不变，甚至稍有减少，这段时间被称为缓慢期。,特征-调整、适应 代谢活跃，体积增大，从介质中快速吸收各种营养物质，大量合成细胞分裂所需的酶类、ATP和其他细胞成分，为细胞分裂作准备。,与水处理的关系 避免缓慢期的出现。 采用处于对数期或代谢旺盛的污泥进行接种，或增加接种量或采用同型反应器的污泥接种可达到缩短缓慢期的效果。,食物充分，微生物是生长不受食料数量的影响。细胞分裂速度最快、繁殖快，活力很强。微生物数目的对数与培养时间呈直线关系-对数生长阶段。,（2）对数期,与水处理的关系 每个处理污水的能力较高，但整体处理效果并不是最好。 a.微生物活力强大，细胞表面的粘

9、液层和荚膜尚未形成，不易凝聚和沉淀，致使出水水质差； b.需充分的食料，即污水中的有机物必须始终具有较高的浓度，（C进水高，C出水高）。,（3）稳定期,菌体生长繁殖速度逐渐下降，同时菌体死亡数目逐渐上升，最后达到新增殖的微生物数与死亡数基本相等。稳定期的活菌数保持相对平衡并处于最大值。稳定期的出现是由于食料的减少和有毒代谢产物的积累。,与水处理的关系 细胞内开始积累贮藏物质和异染颗粒、肝糖等，强化了微生物的生物吸附能力，污泥代谢活性和絮凝沉降性能较好，传统活性污泥法普遍运行在这一范围。,（4）衰亡期,处于静止期的细菌继续培养，细胞的死亡率将逐渐增加，最终群体中活的细胞数目将以对数速率急剧下降，

10、此阶段就被称为衰亡期。,与水处理的关系 延时曝气法处理低浓度有机废水：低浓度有机物满足不了静止期微生物的营养要求，处理效果不会好。若采用延时曝气法，通常延长曝气时间在8h以上，甚至24h，延长水力停留时间，以增大进水量，提高有机负荷，满足微生物的营养要求，从而取得较好的处理效果。 污泥消化：即污泥中的有机物在无氧条件下，被细菌降解为以甲烷为主的污泥气和稳定的污泥(称消化污泥)。,衰亡期的长短与对数生长期一样在不同微生物中变化是很大的，主要与菌种的遗传特性有关。 通过补充营养和能源，以及中和环境毒性，可以减缓死亡期的细胞死亡速率，延长细菌培养物的存活时间。,（二） 连续培养,连续培养与间歇培养不

11、同，它的特点是一方面连续进料，另一方面又连续出料。它又分为两种：恒浊连续培养和恒化连续培养。,1.恒浊连续培养,一种使培养液中细菌的浓度恒定，以浊度为控制指标的培养方式。培养基提供足够量的营养元素，细菌保持最大速率生长。通过控制进料流速使装置内细菌浊度保持一定，保持理论上的对数生长期，可获得大量菌体或与菌体代谢相平衡的代谢产物。这种方式往往用于细菌的生理生化研究。,2.恒化连续培养,新鲜培养基以恒定的流速流入，与培养器内的培养基瞬间混合，培养器内的培养基继而也以相同的流速恒定流出，进水组分及反应器中营养物浓度基本不变，因而这种细菌培养称为恒化连续培养。除了SBR法外，其余的污水生物处理法均采用

12、的是恒化连续培养。,第二节 微生物纯培养群体生长规律,三、连续培养,以一定流速输入新鲜培养液并流出培养物，确保流出的老菌数等于新增殖数，使培养保持对数生长的过程。,优 点：一定生理状态实验材料 提高工业生产效益,保持细菌培养液浊度,恒浊培养,第二节 微生物纯培养群体生长规律,三、连续培养,保持细菌培养液营养物质浓度,恒化培养,三、微生物膜的生长特性,（一）生物膜的定义和成分 定义：一种不可逆的黏附于固体表面的，被微生物胞外多聚物包裹的有组织的微生物群体。 成分：微生物、水（含量97%）、微生物分泌的多聚糖、吸附的营养物质、代谢产物、微生物裂解产物 （二）生物膜生长特性 一种动态的演变过程：细胞

13、粘附 生物膜的发展（微生物菌落的生成） 生物膜成熟与脱落,生物膜法是污水生物处理的一种方法。生物膜法采用各种不同载体，通过污水与载体的不断接触，在载体表面微生物细胞生长和繁殖，由细胞内向外伸展的胞外多聚物使微生物细胞形成孔状结构，称之为生物膜。污水利用生物膜的生物吸附和氧化作用，以降解去除污水中的有机污染物。脱落下来的生物膜与污水进行分离。,二、遗传工程技术在环境保护中的应用,1、降解石油的超级细菌 2、耐汞质粒 3、降解燃料的质粒 质粒：在原核微生物和酵母中，除还存在着另一类较小的环状DNA分子，它们也携带少数遗传性基因。它们在细胞分裂中，也能进行复制，这样的DNA构造称为质粒。,由于新的化

14、学物质的不断发现，难降解污染物的增多，废水处理情况日趋复杂。带有降解某些物质质粒的微生物往往不一定能在某一废水环境中生存，而能在此种废水条件下生存的细菌又不一定具有降解其中某些物质的质粒，因而各国科学家正试图利用遗传工程，把具有降解某些特殊物质的质粒剪切后，连接到受体细胞中，使之带有一种或多种功能用以处理废水。这种用人工方法选出的多质粒、多功能的新菌种称“超级细菌”。,1.降解石油的超级细菌 将能降解脂(含质粒A)的一种假单胞菌作受体细胞，分别将能降解芳烃(质粒B)、芳烃(质粒C)和多环芳烃(质粒D)的质粒，用遗传工程方法人工转入受体细胞，获得多质粒“超级细菌”，可除去原油中23的烃。浮油在一

15、般条件下降解需一年以上时间，用“超级细菌”只需几小时即可把浮油去除，速度快效率高。,基因工程做成的“超级细菌”能吞食和分解多种污染环境的物质。,通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类，用基因工程培育成功的“超级细菌”却能分解石油中的多种烃类化合物。有的还能吞食转化汞、镉等重金属，分解DDT等毒害物质。,2.耐汞质粒 主要是某些微生物使水体汞元素甲基化形成甲基汞，使人及生物中毒。另一面自然界中存在一些耐汞的微生物，它们的耐汞基因在质粒R因子上。 例如，恶臭假单胞菌一般在超过2ugml汞浓度中即被毒死，查克拉巴蒂用质粒转移技术，把嗜油假单胞菌的耐汞质粒(MER质粒)转移到恶臭假单胞菌中去，后者获得M

16、ER质粒，可在5070ugml氯化汞中生长。 3降解燃料的质粒 假单胞菌K24，具有降解1号橙偶氮染料的质粒，假单胞菌K46，具有降解2号橙偶氮染料的质粒。将这两株假单胞菌通过质粒接合到一个菌株内，可获得具有分解两种偶氮染料功能的新菌种。,三、基因工程的生物安全性问题 我国作为一个农业大国、生物多样性大国，又是大豆、水稻等主要农作物的原产地，在发展生物技术的同时十分重视生物安全。对农业转基因生物采取“积极研究、慎重推广、加强管理、稳妥推进”的方针。 据了解，中国大陆目前正在进行研究的基因工程受体生物92种，而申报只有22种，从事此类研究的单位80多个，申报安全性评价的只有19个。 到目前为止，

17、我国只有2部基因工程安全管理规章： 1993年12月国家科委发布的基因工程安全管理办法 1996年7月农业部发布的农业生物基因工程安全管理实施办法,专题4:生物技术安全性和伦理问题,转基因生物的安全性,什么是转基因生物？,利用基因工程技术将基因更有目的和更经济的转移到我们所需要的目标生物中去。 这种生物，如小麦、水稻、大豆、西红柿能提供人类所期望的更多更好的特性。,一、转基因成果令人叹为观止,1.1972年美国斯坦福大学的伯格第一次重组DNA获得成功.,现代基因工程的创始人P伯格（美国,1926 ）在1972年，把两种病毒的DNA连接了起来，获得重组DNA.,思考一下：如果是你来做这个试验，应

18、该如何来操作？,伯格把两种病毒的DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来，于是产生了一种新的重组DNA分子，首次实现两种不同生物的DNA体外连接，获得了第一批重组DNA分子，这标志着基因工程技术的诞生。伯格因此获得了1980年诺贝尔化学奖。,2.转基因的重要成果,(1)微生物方面:把某些重组DNA转移到细菌中表达获得成功,随后,使出现了具有重要经济价值的各种重组微生物,如可以清除石油污染的假单孢杆菌等.,(2)基因制药方面:生物制药已经成为21世纪的朝阳产业.,近十几年来，在利用生物技术制取新药方面取得了惊人的成就，已有不少药物应用于临床。例如人胰岛素、人生

19、长激素、干扰素、乙肝疫苗、人促红细胞生成素（Epo）、GM集落刺激因子（GMCSF）、组织溶纤酶原激活素、白细胞介素2及白介素11等。正在研究的有降钙素基因相关因子、肿瘤坏死因子、表皮生长因子等140多种。随着生物技术药物的发展，多肽与蛋白质类药物的研究与开发，已成为医药工业中一个重要的领域，同时给生物制剂带来了新的挑战。在实际应用中，基因工程药物受到一定限制，如口服应用时生物利用度低，会受到消化酶的破坏，在胃酸作用下不稳定，在体内半衰期较短等，因此只能注射给药或局部用药。为了克服这些缺陷，已开始改为合成这些天然蛋白质的较小活性片段，即所谓“多肽模拟”或“多肽结构域”合成，又叫“小分子结构药物

20、设计”。这类药物可口服，有利于由皮肤、粘膜给药，用于治疗免疫缺陷症、HIV感染、变态反应性疾病、风湿性关节炎等，其制造成本也更低。这种设计思想也已应用于多糖类药物、核酸类药物和模拟酶的有关研究。小分子药物设计属于第二代结构相关性药物设计，所设计的分子能替代原先天然活性蛋白与特异靶相互作用。,(2)基因制药方面:生物制药已经成为21世纪的 朝阳产业.,美国近几年基因制药发展情况,(3)转基因动物方面:科学家在培育生长迅速、营养品质优良的转基因家畜、家禽方面,不断取得辉煌成就.同时,科学家还把转基因动物变 成生物反应器,思考：为什么长得快？,转入荧光素酶蛋白基因的发荧光烟草,(4)转基因植物方面:

21、,转基因金大米,目前,科学家已经培育出了大批具有抗虫、抗病、抗除草剂、抗逆等全新性状的农作物.,全球转基因农作物种植面积最大的前四个国家是： 美国、阿根廷、加拿大、中国,转基因农作物中，以种植转基因大豆和玉米最多，其次是转基因棉花和油菜。,转基因食品有哪些优点？,解决粮食的短缺问题 减少农药的使用，从而减少环境污染 节省生产成本，降低粮食售价 增加粮食营养，提高附加值 增加食物的种类，提升食物的品质 促进生产效率，带动相关产业的发展。,转基因生物 安全吗？,市民谈“转基因”色变。市民疑问：转基因食品安全吗？,转基因食品安全吗？国际上对于转基因食品的争论颇多，比如前不久津巴布韦等非洲国家拒绝了美

22、国提供的转基因食品，有的非洲国家领导人甚至表示“宁可饿死，也不吃转基因食品！”。对于这个问题，刘德虎研究员认为，转基因食品是安全的，美国人已经吃了6年，没有发现任何危险。他说，转基因食品安全不安全主要是看两个问题：一、转基因食品自身的安全。二、转基因食品对环境有没有危害。“事实已经证明，转基因食品本身没有任何问题。我吃过了转基因大豆、玉米和预防乙肝的西红柿，我现在身体健康。美国人吃了好多种转基因食品，也没有发生不测。这主要还是人们对转基因食品的看法在作怪。当然，对这种问题我们应该慎重。但是，事实已经证明了转基因食品没有问题。”刘德虎研究员说。,其实，作为一名有责任感的科学家，伯格教授在DNA重

23、组技术诞生之初就已经敏锐地意识到这种技术潜在的影响力，他曾写信给美国国家科学院，建议将重组DNA技术的研究工作先冻结一年，以便让科学家们有时间讨论这项技术的安全性。,二、对转基因生物安全性的争论,a.对基因的结构,基因间的相互作用及基因的调控机制都了解的相当有限;b.转移的基因虽然是功能已知的基因,但不少是异种生物的基因;c.外源基因插入宿主基因组的部分往往是随机的.,1、在转基因生物中,有时候会出现一些人们意想不到的后果，原因是：,食物安全、生物安全、环境安全,2、转基因生物与食物安全,a.转基因食物引起食物安全性问题的理由,b.不必担心转基因食物安全性的理由,反对“实质性等同”,安全性检测

24、问题,滞后效应,担心出现新的过敏原,担心营养成分的改变,把动物蛋白基因转入农作物，是否侵犯了宗教信仰或素食者的权益,没能足够的证据证明转基因食物有问题;,多环节、严谨的安全性评价,可以保证转基因食物的安全,科学家的负责态度可以防止新过敏原的产生,至今尚未发现食用转基因食品而影响人体健康的事例,3、转基因生物与生物安全,a.引起生物安全的理由,b.不引起生物安全的理由,转基因植物可能会扩散到种植区以外，成为杂草,转基因生物可能成为“入侵的外来物种”威胁生态其他生物的生存,外源基因可能与感染转基因生物的某些细菌获病毒杂交，重组出对人类或其他生物有害的病原体。,有可能使杂草成为除不掉的“超级杂草”,

25、扩散到种植区以外的转基因农作物很快死亡。,转基因农作物要表现出新性状，必须有一定的水、肥等条件，以及配套的种植技术。,由于存在生殖隔离，转基因农作物很难与其他植物杂交。,花粉传播的距离有限，时间有限。,4、转基因生物与环境安全,a.引起环境安全的理由:,b.不引起环境安全的理由:,打破自然物种的原有界限,改变了生态系统中能量流动和物质循环。,重组微生物在降解某些化合物过程中所产生的中间产物，可能对人类的生活环境造成二次污染。,重组DNA与微生物杂交,可能产生有害的病原微生物。,转基因植物花粉中的有毒物质可通过蜜蜂进入蜜蜂,再经过食物链传递，有可能进入其他动物和人体内。,转基因不会改变生物原有的

26、分类地位,不会破坏生态系统的稳定性。,转基因抗虫作物的种植,减少了农药的使用量。,抗除草剂农作物的种植,减轻了农田管理的负担,保护了农田的土壤环境。,新闻报道不实，增加了公众对转基因农作物的恐惧感。,三、理性看待转基因技术,1、要正视转基因技术带来的安全性问题，切实认识到个别有害转基因生物的危害性，要趋利避害，而不能因噎废食。,2、完善相应的法令法规，利用法制手段确保转基因生物的安全性。 如我国1993年制定的基因工程安全管理办法和2002年颁布的农业转基因生物标识管理办法。,四、课堂演练,1下列哪项不是转基因食物潜在的安全隐患( ) A转基因植物有可能合成出对人体有直接毒性或潜在毒性的蛋白质

27、 B转基因植物合成的某些新的蛋白质有可能成为某些人的过敏源 C某些转基因生物可以合成干扰素，进人人体增强相应细胞的免疫力 D某些基因足以使植物体内某些代谢途径发生变化，导致转基因农作物营养成分的改变,C,2下列哪项不是转基因成果( ) A清除石油污染的假单孢杆菌 B高产青霉素菌株 C转基因抗虫棉 D巨型小鼠,B,320世纪90年代，乌干达木薯业遭到了病害的毁灭性打击。科学家究其原因发现，是一种新的病毒引发的疾病，而这种新病毒是由两种已知病毒重组产生的。这一事实有力地支持了下列哪一观点( ) A转基因生物有可能成为“入侵的外来物种，威胁生态系统中其他生物的生存 B导人转基因生物的外源基因有可能与

28、感染转基因生物的某些细菌或病原体杂交，从而重组出对人类或其他生物有害的病原体 C转基因植物的抗除草剂基因，有可能通过花粉传播而进入杂草中，使杂草成为除不掉的“超级杂草” D抗虫棉能抵抗棉铃虫，但随着棉铃虫抗性的增强，抗虫棉有可能被淘汰,B,4科学家发现栽种含有抗除草剂基因的农作物后，会使附近的、与其亲缘关系较近的野生植物也获得抗除草剂基因。下列说法错误的是( ) A野生植物通过自然杂交获得抗除草 剂基因 B野生植物发生了基因突变 C基因工程会导致基因污染 D转基因生物会危及生物圈的稳定,B,基因一旦被改动，一方面可能引起生物体内一系列未知的结构与功能的变化；另一方面，转基因操作对生物体的影响会通过遗传传递。,转基因技术的安全性问题,外源基因引入后，是否会影响其他重要的调节基因，甚至会激活原癌基因？ 转基因技术广泛应用是否会导致难以消灭的新病原物出现？ 是否会造成生态学灾难？ 人类摄食大量转基因食品是否会影响人类及其后代的健康？,实质性等同原则：转基因生物与自然存在的传统生物在相同条件下进行性状表现的比较。比较的内容包括生理性状、分子特性、营养成分、毒素含量和过敏源等是否有等同性。如果实质上是相同