昆医分生基因治疗1不考试.ppt

1、基因治疗与基因诊断,昆明医学院第一附属医院 肿瘤内科主任兼科技教育处 处长 董 坚 硕士 博士生导师,What is Gene Therapy?,Gene therapy is the introduction of genetic material into cells for therapeutic purposes One major goal of gene therapy is to supply cells with healthy copies of missing or flawed genes,基因治疗概况,基因治疗，是基于修饰活细胞遗传物质而进行的医学干预，是一种以预防和治

2、疗疾病为目的的人类基因转移技术。即：,以改变细胞遗传物质为基础的生物医学治疗。,基因治疗概况,基因研究与治疗发展历程,发现DNA双螺旋结构,建立DNA重组技术,在大肠杆菌中成功表达胰岛素,第一个基因工程药物重组人胰岛素上市,美国批准第一个体细胞基因治疗方案，治疗严重综合性免疫缺损症,英国培养出第一只克隆羊多莉,人类基因组计划“工作草图”绘制完毕,基因治疗产品上市,1953,1973,1978,1982,1990,1997,2000,2004,基因治疗的发展史及研究概况,1967年Nirenbeg首先提出基因工程可用于人类疾病治疗的设想。 1980年Cline首次将外源基因转导入小鼠获得成功，次

3、年对2名重症-地中海贫血患者进行治疗，虽未获成功， 1985年美联邦国家卫生研究院(NIH)成立了基因治疗委员会，并于1989年首次批准Arderson等将抗新霉素基因导入黑色素瘤患者的肿瘤侵润淋巴细胞(TIL)作为标记基因。 1990年Blaese将正常人的腺苷脱胺酶基因导入2名腺苷胱氨酸（ADA）缺乏症患者的淋巴细胞获得成功，成为医学史上的重要里程碑。 1991年Szczylik 等在小鼠慢粒白血病模型上，将反义寡核苷酸导入肿瘤细胞，阻断了癌细胞的增殖. 在我国，1991年12月复旦大学遗传研究所与第二军医大学长海医院合作，以携带凝血因子IX基因的反转录病毒作为载体，对两例血友病B患者进行

4、了首次基因治疗。,恶 性 肿 瘤 心 血 管 疾 病 遗 传 病 感 染 性 疾 病,威胁人类健康的重大疾病,基因治疗对象,基因治疗概况,基因治疗药与基因工程药,DNA,PROTEIN,RNA,基因工程药,基因治疗药,基因治疗概况,治疗基因,载体,靶细胞,基因治疗制品,基因治疗要素,基因治疗概况,最理想的方式,目前的主要方式,基因治疗策略,基因治疗概况,基因替代（Gene Replacement） 基因修复（Gene Modification） 基因添加（Gene Addition） 基因失活（Gene block）,体细胞基因治疗 生殖细胞基因治疗,基因治疗种类,基因治疗概况,基因治疗的途径

5、因受体细胞的不同分为两种： 生殖细胞基因治疗(germ cell gene therapy)：是将正常外源基因转移到患者的生殖细胞(精细胞、卵细胞及中早期胚胎)中，使子代成为正常的个体。由于此法改变了生殖细胞的遗传物质，影响人类基因构成，并影响到子代的发育，同时涉及一系列的伦理问题，美联邦国家卫生研究院(NIH)目前规定禁止用于人类，仅可用于动物实验研究。 体细胞基因治疗(somatic cell gene therapy)：是指将正常基因转移到体细胞，使之表达基因产物，从而达到治疗目的。由于该疗法只涉及体细胞的遗传改变，而不影响子代，故到目前为止，人类所进行的基因治疗，均为体细胞基因治疗,体

6、外基因治疗(Ex vivo)：从病人体内获取细胞，体外培养并进行基因转移后，重新输入患者体内,前列腺癌细胞转染细胞因子基因后回输到患者体内，肿瘤转移灶被T细胞及NK细胞附着。,基因治疗途径,基因治疗概述,体内基因治疗(In vivo)：直接将基因或改造后的病毒(插入目的基因)导入人体患病组织中,携p53基因的重组腺病毒导入人体肿瘤组织引起肿瘤细胞裂解,基因治疗途径,基因治疗概况,基因治疗的要求是： 向一定的细胞导入治疗基因； 输送到细胞核，并整合到DNA的正确位置； 稳定的表达，包括转录、翻译、定位和修饰。,基因治疗的途径,选择靶细胞的原则是： 必须较坚固，足以耐受处理，易于由人体分离并便于回

7、输。 具有增殖优势，生命周期长，能存活几个月甚至几年，最好可延续至病人的整个生命期。 易于受外源性物质的转化。 目前使用较多的是骨髓干细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞和肌细胞等。肿瘤基因治疗常用的靶细胞是肿瘤细胞自身，其次是淋巴细胞和造血干细胞。,基因转染/转导的方法,基因转移方法分三类： 化学法：包括磷酸盐沉淀、脂质体(Plasmid-liposome complex)包埋、多聚季铵盐和DEAE-葡萄糖等化学试剂转移。这些方法通过改变细胞膜的通透性或增加DNA与细胞的吸附而实施基因转移。 物理法：包括电穿孔、显微注射、裸露DNA直接注射、颗粒轰击等。物理方法转移的遗传物质，在细胞内

8、易受DNA酶降解，不易稳定地存在于细胞基因中。 生物法：生物法主要是指病毒介导(以病毒为载体)的基因转移。包括DNA病毒如腺病毒(AV)、腺病毒相关病毒(AAV)、单纯疱疹病毒(HSV)、细小病毒(HI)、痘苗病毒(VV)和RNA病毒即反转录病毒(RV)。,生物传导的方法,Adenoviruses enter cells by receptor-mediated endocytosis: Binding of viral coat protein to a specific receptor on the plasma membrane of cells is followed by endo

9、cytosis, a process in which the plasma membrane invaginates and then pinches off to form an intracellular vesicle (endosome). Subsequent vesicle disruption by adenovirus proteins allows virions to escape and migrate towards the nucleus where viral DNA enters through pores in the nuclear envelope. Ad

10、apted from Curiel (1994) with permission from the New York Academy of Sciences,Gene transfer via the receptor-mediated endocytosis pathway. The negatively charged plasmid DNA can bind reversibly to the positively charged polylysine attached to the transferrin molecule. During this process, the DNA i

11、s condensed into a compact circular toroid with the transferrin molecules located externally and free to bind to cell surface transferrin receptors. Following initial endosome formation, a portion of the endocytosed conjugates can migrate to the nucleus, although a very significant fraction is alter

12、natively transferred to lysosomes where the DNA is degraded. The efficiency of transfer can be increased by the further refinement of coupling an inactivated adenovirus to the DNA transferrin complex: following endocytosis and transport to lysosomes, the added adenovirus causes vesicle disruption ,

13、allowing the DNA to avoid degradation and to survive in the cytoplasm. Adapted from Curiel (1994) with permission from The New York Academy of Sciences.,In vivo liposome gene delivery. (A) and (B) Structure of liposomes. Liposomes are synthetic vesicles which can form spontaneously in aqueous soluti

14、on following artificial mixing of lipid molecules. In some cases, a phospholipid bilayer is formed, with hydrophilic phosphate groups located on the external surfaces and hydrophobic lipids located internally (left). In other cases there is a multilamellar lipid envelope. Anionic liposomes have a ne

15、gative surface charge and when the lipid constitutents are mixed with negatively charged DNA molecules (see panel C below), the DNA is internalized. Cationic liposomes have a surface positive charge and DNA molecules bind to the surface of liposomes. (C) Use of liposomes to transfer genes into cells

16、. This figure illustrates the use of anionic liposomes to transfer internally located DNA into cells. The plasma membranes of cells are fluid structures whose principal components are phospholipids, and so mixing of cells and liposomes can result in occasional fusion between the lipid bilayer of the

17、 liposome and the plasma membrane. When this happens the cloned genes can be transferred into the cytoplasm of a cell, and can thence migrate to the nucleus by passive diffusion through the pores of the nuclear envelope. Note that, in practice, cationic liposomes have been more widely used for trans

18、ferring DNA into cells.,基因的整合途径,Exogenous genes that integrate into chromosomes can be stably transmitted to all daughter cells, unlike episomal (extrachromosomal) genes. The figure illustrates two possible fates of genes that have been transferred into nucleated cells. Gene therapy involving chromo

19、somal integration of exogenous genes offers the possibility of continued stable expression of the inserted gene and a permanent cure, but carries certain risks, notably the possibility that one of the integration events may result in cancer . By contrast, episomal genes which do not integrate but re

20、plicate extrachromosomally (under the control of a vector origin of replication) may not segregate to all daughter cells during subsequent mitoses. As a result, this type of approach has been particularly applied in gene therapies where the target tissue consists of nondividing cells 。,基因转导的载体,转运载体要

21、求： 能够高效转运治疗所需的一个或多个目的基因； 载体具有准确的靶向性，无免疫原性，易于生产、提纯； 无致病性，对受者及环境无危害； 使其所携带的基因能按要求准确表达。 理想载体目前仍无法得到。病毒为载体介导的基因转移具有靶向性好、效率高的特点，另外可利用细胞自身机制生产所需要的目的蛋白质，是目前进入临床前期研究的较为理想的载体之一。,目前适用基因治疗的疾病, 遗传性疾病，首选单基因缺陷症如镰状细胞病、甲型和乙型血友病、地中海贫血、ADA缺乏所致重症联合免疫缺陷病、嘌呤核苷磷酸化酶PNP缺乏症、遗传性1-抗胰蛋白酶缺乏症、囊性纤维化等。 免疫缺乏病，如白细胞粘附分子缺陷病、TcR-CD3缺乏症

22、。 肿瘤及恶性血液病，主要适用于基因突变者如膀胱癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、神经母细胞瘤、黑色素瘤、白血病等。 其他疾病如糖尿病、肌营养不良、高血压、某些精神病、AIDS、慢性活动型肝炎、心血管疾病等。,单基因疾病的基因治疗,Ex vivo gene augmentation therapy for adenosine deaminase (ADA) deficiency. Note that identification of suitably transformed cells is helped by having an appropriate selectable marker in t

23、he retrovirus vector, such as a neoR gene which confers resistance to the neomycin analog G418 . Following infection, the target cells can be cultured in a medium containing G418 to select for the presence of retroviral sequences, and then assayed by PCR for the presence of the inserted ADA gene. Su

24、itable ADA+ cells can then be expanded in culture before being reintroduced into the patient.,直接基因水平治疗； 副作用小； 技术含量高，生产成本低； 病毒液性质稳定； 生产简单可靠，无环境污染。,基因治疗的优势,基因治疗概况,1990年,美国W.F.Anderson 严重复合免疫缺陷病SCID 4岁女孩， Ashanti De silva 13岁，正常生活,第一项体细胞基因治疗临床试验,基因治疗概况,两项新措施： （1）制定了基因治疗临床试验监查计划；（2）定期开办基因治疗安全性专题研讨会。 并否决

25、了一项由少数激进分子提出的“停止基因治疗临床试验”议案。,1999年9月17日，18岁的Jesse Gelsinger参加宾夕法尼亚大学治疗鸟氨酸甲酰氨基转移酶（OTC）缺乏症临床试验后死亡。,美国Gelsinger事件,调查结果： 应只包括女性；血氨值已偏高； 门静脉注射大剂量的重组腺病毒 （1X1014VP） 调查结论： 临床试验存在违规行为，而与进 行的基因治疗的制品本身无直接 关系。,基因治疗概况,巴黎Necker Enfants Malade 医院采用逆转录病毒载体携带IL2RG/c基因治疗重症联合免疫缺陷病（SCID-X1）的临床试验；1999.10起，9/10名儿童的免疫力得到了

26、恢复； 2002.10-2005.1， 3/9例分别在近3年及5年后相继表现出T细胞白血病的症状,法国“气泡儿童”事件,法国政府立即终止了该项试验。美国FDA暂停了27项同类以逆转录 病毒为载体基因治疗临床试验。英国则表示不会停止这类基因治疗 临床试验。意大利的米兰，类似的临床试验仍在进行。 研究表明 IL2RG/c基因本身有缺陷，导致白血病的发生。,基因治疗概况,Bubble-boy,基因治疗概况,基因治疗方案总数 1309项,腺病毒载体（最常用） 331项（24.7%）,p53 gene 65项,Ad-p53 62项,II/III & III期 45项,其中：Ad-p53 项目 12项,I

27、II期 32项,其中：Ad-p53 项目 6项,http:/www.wiley.co.uk/genmed/clinical/,截止2007年7月，全世界批准的基因治疗临床试验方案概况,基因治疗概况,国际基因治疗研究概况-地理分布,基因治疗概况,Total 1309 Updated July. 2007,国际基因治疗研究概况-国家分布,基因治疗概况,基因治疗概述,国际基因治疗研究概况-目的基因,国际基因治疗研究概况-适应症,基因治疗概况,国际基因治疗研究概况-载体,基因治疗概况,国际基因治疗研究概况-临床分期,基因治疗概述,国际基因治疗研究概况-年度状况,基因治疗概述,国内基因治疗及相关研究概况

28、,基因治疗概况,基因治疗概况,人基因治疗研究和制剂质量控制指导原则,基因治疗概况,基因诊断,基因诊断: 是从基因水平阐明疾病的病因所在，是属于全新内容、全新技术和全新概念的实验室诊断方法 。 它是以DNA和RNA为诊断材料，通过检查基因的存在、缺陷和表达异常，对人体健康状态和疾病作出诊断的方法和过程。,基因诊断的基本原理： 是通过检测DNA或RNA的结构变化、量的多少及表达功能是否正常，以确定被检查者是否存在基因水平的异常变化，以此作为疾病确诊的依据。 基因诊断的临床意义： 在于可以对疾病作出早期、确切的诊断，可以确定个体对疾病的易感性以及疾病的分期分型、疗效监测、预后判断等。 近十年来，基因

29、诊断技术已逐步成为实验诊断的常规技术，基因诊断的原理和技术已广泛应用于临床各个学科领域，包括遗传学、传染病学、肿瘤学、血液学、免疫学以及法医学等领域。,基因诊断的基本方法, 基因突变的诊断； 多态性分析； 基因表达的检测； 外源DNA的检测。,基因诊断中常用的分子生物学技术,基因诊断中常用的技术主要包括： 1、核酸分子杂交； 2、DNA指纹 3、聚合酶链式反应(PCR)； 4、单链构象多态性检测(SSCP)； 5、限制酶酶谱分析； 6、DNA序列测序 7、DNA芯片技术。,遗传性疾病基因诊断,1. 直接诊断 直接诊断的前提是被检测基因必须已被克隆，基因的正常序列和结构已阐明。采用基因突变的诊断方法，通过各种分子生物学技术直接检测导致遗传性疾病发生的各种基因突变。 2. 间接诊断 在许多情况下，疾病的致病基因尚未被克隆而无法进行直接诊断，但若致病位点已在基因组中被定位，则可以采用间接诊断策略。即采用多态性连锁分析的方法，寻找具有基因缺陷的染色体，并判断被检者