高通量测序及个体化医学.ppt

1、高通量测序和个体化医疗,测序,测序是指通过专业的分析工具测定物种细胞内DNA或RNA碱基排序的过程。根据方法的不同，目前测序主要分为Sanger法测序和高通量测序。 Sanger法测序又称为一代测序，该方法利用一种特定的DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，通过掺入一种链终止核苷酸来完成测序。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入有限量的不同碱基类型的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，从而使延长的寡聚核苷酸选择性地终止延伸，终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的

2、相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。,高通量测序 高通量测序技术（High-throughputSequencing）是对传统Sanger测序（称为一代测序技术）革命性的改变，由于该种方法能够一次同时对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定，因此在有些文献中称其为下一代或二代测序技术(NextGenerationSequencing，NGS)，足见其划时代的改变。同时，高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌

3、的分析成为可能，所以又被称为深度测序(DeepSequencing),单细胞全基因组测序,2014年1月自然方法学（Nature Methods）上发表年度特别报道，将“单细胞测序”（Singled out for sequencing）的应用列为2013年度最重要的方法学进展。 单细胞全基因组测序技术是在单细胞水平对全基因组进行扩增与测序的一项新技术。其原理是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA进行扩增，获得高覆盖率的完整的基因组之后通过外显子捕获进而高通量测序用于揭示细胞群体差异和细胞进化关系。它解决了用组织样本测序时或样本少无法解决的细胞异质性难题。为从单核苷酸水平深入研究癌症发生、发展

4、机制及其诊断、治疗提供了新的研究思路并开辟了新的研究方向。,全基因组扩增技术主要分为两种类型： 一是基于热循环以PCR为基础的扩增技术，如简并寡核苷酸引物PCR (DOP-PCR)、连接反应介导的PCR (LM-PCR)、扩增前引物延伸反应 (PEP)等； 二是基于等温反应不以PCR为基础的扩增技术，如多重置换扩增 (MDA) 和基于引物酶的全基因组扩增 (pWGA)。 MDA（不以PCR为基础的扩增技术）是目前公认的最好的单细胞基因组扩增技术，它能对全基因组进行高保真的均匀扩增，扩增出10100kb大小的片段，能提供大量均一完整的全基因组序列。但是MDA也有一些缺点，特别是显著的非特异扩增，

5、往往空白对照样品也总是“无中生有”地产生大量的DNA，另外就是仍然存在序列偏差。另外，对测序得到 的大量数据结果的专业分析也是一个重大的挑战。单细胞全基因组测序正在从基础研究走向临床应用。,个体化医疗,传统的循证医学是结合临床医生的个人实践经验和客观的科学研究证据，对于症状相同的病人使用相同剂量的同种药物进行治疗，但治疗效果却千差万别。传统治疗方案显示，肿瘤的无效率高达75%，糖尿病无效率43%，抑郁症无效率也有38%。人们逐渐意识到大多数疾病的发生是自身遗传密码和外界环境共同作用的结果。 精准医疗借助可监测的遗传信息和环境信息，针对个体提供定制的优化治疗方案，提升现有治疗水平，并尽量在发病前

6、就有望有效预防。,第一步 基因检测,从人类发现DNA的双螺旋结构，第一次窥探了生命体如何继承和储存生物信息，到“人类基因组计划”宣布完成，再到高通量测序技术的出现，正逐渐开启“个人基因组”的时代。个人基因组学是实现“精准医疗”的一把利器，而“精准医疗计划”首先就是要完成一百万人的基因组测序。癌症是基因组疾病，每个肿瘤都有自己独特的基因图谱。精准医疗就是通过检测癌症患者的基因信息，利用DNA测序技术确认导致患者患病的基因或者受检者是否携带有肿瘤易感基因，来诊断或治疗患者的疾病。针对每位患者的基因图谱，了解癌细胞内的遗传改变，从而选择更有效的治疗癌症的方式。高通量测序具有较高的精度以及可准确诊断病

7、患基因个体化差异，基因检测技术则在精度上更为准确，可测通量更多，使得基因测序不仅是一种优秀的分子诊断方法，而且是目前最适宜的个体化诊断方式。,第二步 建立基因数据库,首先，建立一个整合肿瘤遗传信息与肿瘤疗效数据的信息平台，建立一个对科学家和临床医生同样适用的分子信息和临床知识整合系统。这一知识体系将包括遗传学、生物化学、环境和病人临床信息等各方面的数据，对数据库中各种混合数据进行有效的整合，建立信息平台支持应对肿瘤治疗的基因数据信息，开展更先进合理的生物信息学研究来满足海量数据的分析要求。 同时大规模存储并分析基因数据，对相应大数据的把握、获取、分析，应用大数据可用于构建预测癌症、提高诊断精度

8、以及能够反映疗效的模型，从而打通从基因组数据到临床应用的道路，发现基因突变和疾病的关系。 基因数据的另一个重要用途就是预测健康风险。能够预测个体感染某种疾病的可能性并进行个性化的治疗和药物选择，以便获得最大化的疗效，并最大程度上减少不良反应；还能够用来预测和确定遗传疾病，通过详细的了解个体的基因情况，确定遗传变异导致个体患某种遗传疾病的可能性。在不久的将来，当数据库足够大时，我们就可以用它作为参照，来推断所有人的健康风险，不论他之前是否参加了这项研究。,第三步 精准的药物靶向治疗：,传统药物治疗对于病人通常是对症下药，千篇一律。依赖靶向药物等技术进行的精准治疗，就是以大数据分析结果作为参考，根

9、据患者的基因和所处的环境来为其定制个性化治疗方案的过程，即在合适的时间，给合适的患者，进行合适的治疗。“精准医疗”计划的目标是更好地了解人类疾病的致病机理，并根据个人基因组特点靶向用药。 传统的肿瘤治疗主要有手术、放疗及化疗三种治疗方式，治疗过程往往伴随病人巨大的身体痛苦与心理伤害。而个体化治疗可以实现针对肿瘤细胞和正常细胞间的差异辨别，只攻击肿瘤细胞并且同时杀死驱动肿瘤生长的细胞亚群，而对正常细胞影响较小。可以通过检测肿瘤靶向药物靶点，在分子靶向药使用之前检测病人是否携带药物靶点，实现肿瘤的个体化治疗，以提高用药效率，达到最佳疗效并减少治疗费用。也可以通过临床肿瘤基因组学的研究，筛选并发现不

10、同患者对同种药物治疗存在个体差异的遗传指标，检测这些指标向临床医师提供实验数据，从而使临床医生在治疗药物的选择上更精确，以提高抗肿瘤药物治疗的安全性和有效性，从而实现真正意义上的肿瘤个体化治疗。,非小细胞性肺癌治疗进展,中国埃克替尼治疗非小细胞肺癌专家共识（2016 年版） EGFR （表皮生长因子受体）基因突变状态是晚期 NSCLC 最重要的疗效预测因子和选择治疗方式的分子指标。突变最常见于 18-21 外显子，其中 19 外显子缺失突变和 21 外显子点突变是最常见的 EGFR 基因敏感突变。最新研究发现，EGFR 基因敏感突变的晚期 NSCLC 患者接受 EGFR-TKI 治疗后的中位生存时间可达到 4 年。 多项研究结果也显示，在非选择的中国 NSCLC 患者 EGFR 基因敏感突变率约为 3