《细胞培养》课件.ppt

1、细胞培养：将动物组织或细胞分散成单个细胞，在模拟机体内的生长环境条件下，使其在体外环境继续生长增殖的过程，称之为细胞培养。,体外培养：原代培养(primary culture亦称初代培养) 传代培养(subculture,亦称继代培养)。,2.3 细胞的基本培养技术,原代培养：是指将机体取出的组织或细胞进行初次培养的 过程。初次培养的细胞大约增殖10代左右，这 样的细胞称为原代细胞(primary cell),传代培养：从原代培养的细胞继续转接培养称为传代培 养。在in vitro条件下持续传代培养的细胞称 为传代细胞(subculture cell)。,2.3 细胞的基本培养技术,2.1 原

2、代培养,(1) 组织取材 (2) 组织细胞的分离 (3) 培养方法,2.3 细胞的基本培养技术,取材： 鸡胚组织 鼠胚组织 皮肤和黏膜 血细胞 内脏和实体瘤,2.3 细胞的基本培养技术,组织细胞分离： 机械法 离心(500-1000rpm) 切割分散 机械分散 消化法 胰蛋白酶消化 胶原酶消化 螯合剂消化,2.3 细胞的基本培养技术,2.3.2 传代培养,第一次传代 成功与否细胞形成单层的面积 细胞活性 常规传代 (1)贴壁细胞的消化法传代 (2)悬浮细胞传代,2.3 细胞的基本培养技术,2.3 细胞的基本培养技术,2.3 细胞的基本培养技术,PBS清洗,加胰酶,2.3 细胞的基本培养技术,2

3、.3 细胞的基本培养技术,2.3 细胞的基本培养技术,贴壁细胞传代时应注意问题：,选择适当时机 不同细胞区别对待 消化液浓度适宜 细胞接种数量适当多些 部分贴壁细胞可不经消化处理直接吹打,2.3 细胞的基本培养技术,2.3.3 常用培养技术,悬滴培养 培养瓶培养 旋转管培养 克隆培养法 细胞同步化培养 动物细胞的大规模培养,2.3 细胞的基本培养技术,1907年 Harrison 单盖玻片培养,1925年 Maxinmow 双盖玻片培养,2.3.3.1悬滴培养,2.3 细胞的基本培养技术,2.3 细胞的基本培养技术,2.3.3.3 旋转瓶培养,2.3.3.4克隆培养法,克隆培养法:又称单细胞分

4、离培养法，就是将从细 胞悬液中获得的单个细胞用于培养，使之重新 繁衍成一个新的细胞群体的培养技术。,细胞株:克隆培养所获得的培养产物遗传特性几乎完 全相同，即培养得到 的后裔细胞群来源于一 个共同的祖细胞，成细胞株（cell strain),2.3 细胞的基本培养技术,影响克隆形成率的因素,接种的细胞密度 培养基 血清 饲养细胞 激素和生长因子 CO2 适应性生长基质,2.3 细胞的基本培养技术,克隆培养技术,稀释铺板法 饲养层克隆法 胶原膜板或血纤维蛋白膜层板克隆法 琼脂克隆法 多孔塑料培养板单细胞克隆法,2.3 细胞的基本培养技术,2.3.3.5 细胞同步化培养,细胞周期的不同阶段，细胞体

5、积、密度、黏附度、吸光性等特征都有区别。,选择细胞同步化： (1)M期细胞震摇脱落法 (2)离心洗脱法 (3)密度沉降法,2.3 细胞的基本培养技术,诱导细胞同步化：,(1)血清饥饿法 G1期 (2)异亮氨酸营养缺乏法 G1期 (3)DNA合成抑制剂阻断法 S期 (4)秋水仙素阻断法 有丝分裂中期,2.3 细胞的基本培养技术,细胞系：初代培养物开始第一次传代培养后的细 胞，即称之为细胞系。 细胞株：从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细 胞分离培养或通过筛选的方法，由单细 胞增殖形成的细胞群，称细胞株。,2.4 细胞系和细胞株的建立,2.4.1建立细胞系（或株）的要求,组织来源：物种、年龄、性别、

6、器官或组织 细胞生物学检测：形态、结构、生长曲线、分裂 指数、倍增时间、接种率、 分泌产物 培养条件和方法：培养基、血清种类、用量,2.4 细胞系和细胞株的建立,细胞冻存冻存液 70%培养基+20%血清+10%DMSO,结合细胞中水分子,降温时减少冰晶形成,2.5 细胞的冻存、复苏与运输,细胞冻存:,2.5 细胞的冻存、复苏与运输,细胞复苏,贴身运输 冰瓶运输 液氮罐运输,细胞运输,2.5 细胞的冻存、复苏与运输,细胞培养的污染问题十分重要，一旦发生污染，将导致前功尽弃。所以细胞培养一定要建立无菌观念。遇到培养污染要分析原因，及时处理。,2.6 培养细胞的污染、检测及防止,2.6.1污染判定,

7、出现以下情况，培养的细胞可能有污染： 培养液的酸碱度发生异常的改变。 培养液出现混浊。 光镜观察到菌丝和颗粒。 细胞出现死亡或增殖缓慢等。,2.6 培养细胞的污染、检测及防止,2.6.2 污染途径,空气 器材 操作 血清 组织样本,2.6 培养细胞的污染、检测及防止,2.6.3 污染物,细菌 酵母菌 真菌 支原体 病毒等,2.6 培养细胞的污染、检测及防止,革兰氏阴性菌,2.6 培养细胞的污染、检测及防止,2.6 培养细胞的污染、检测及防止,真菌,2.6.4 污染物的检测,支原体检测: 支原体污染细胞后，能抑制细胞代谢和生长，改变核酸合成，影响细胞的抗原性，引起细胞染色体改变，具有类病毒作用。

8、在培养细胞初期，由于支原体对细胞的繁殖影响较小而往往被忽略。,2.6 培养细胞的污染、检测及防止,1）荧光技术检测： 支原体含有DNA，能与一种荧光染料Hoechest 33258特异性的结合，可根据细胞表面的荧光 来显示细胞是否污染有支原体。 2）直接培养法： 4）DNA分子杂交： 检测完毕后，所有实验用具均应经过高压消毒处理。,2.6 培养细胞的污染、检测及防止,支原体污染的DNA检测图:,正常细胞 支原体污染后,2.6 培养细胞的污染、检测及防止,解决方案:,抗生素排除法:庆大霉素,四环素,卡那霉素,红霉素等均可. 加温处理:将受支原体污染的细胞置于41中作用510h可基本杀灭,但对细胞

9、有影响.,2.6 培养细胞的污染、检测及防止,细胞间交叉污染,为避免细胞间交叉污染，应注意： 了解各细胞系的特征； 培养各细胞系的操作手续要快速； 培养各细胞系不用同一瓶的培养液和酶等； 吸过培养液和细胞悬液的吸管，不能放回储存培养液和酶的瓶内； 经常检查培养物特征，注意任何突然的形态学改变，通过染色体或同工酶谱分析，检查是否有交叉污染。,2.6 培养细胞的污染、检测及防止,实现无血清无蛋白培养 改变细胞的能量代谢途径 促进细胞贴壁性 增强细胞抗凋亡活性 控制增殖速率 改善重组蛋白糖基化,生产用动物细胞的代谢工程优化改造：,2.7 动物细胞的大规模培养,动物细胞的大规模培养,悬浮培养 微载体培

10、养 微囊化培养 中空纤维法,2.7 动物细胞的大规模培养,微载体培养,1967年 Van Wezel 微载体系统培养贴壁细胞,交联葡聚糖为基质 Cytodex、,微载体是直径的0250m的微珠。,2.7 动物细胞的大规模培养,CytodexI: 带有正电荷,细胞毒性最小,应用最广泛对培 养液中的血清有较强的吸附作用,Cytodex :表面带正电荷,电荷密度较低基本不吸附培养 液中的成分及代谢产物,很适合于培养病毒及 经原代培养二倍体细胞生产细胞制品。,Cytodex:不带电荷,包裹胶原层,与细胞有很好的亲和性 而无细胞毒性,适于各类贴壁细胞的生长，尤 其适合贴壁性差、存活率低的细胞。,2.7

11、动物细胞的大规模培养,特征:,生物相容性 简便无毒害固定化过程 良好的传质特性 良好的机械稳定性 最大的比表面积 适合细胞生长的形状和大小 颗粒分布均一,能高压灭菌 可重复利用，易于清洗 能保护细胞免受机械损伤 接种方便 能固定大部分细胞 适于大规模培养 易使细胞、载体与培养 基分离,2.7 动物细胞的大规模培养,其他:,纤维素为基质 DE52、DE53 蛋白质为基质 变性胶原 高分子材料为基质 硅胶、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯 无机玻璃为基质等,2.7 动物细胞的大规模培养,微囊化培养,生长受保护 体积增大 减少搅拌产生的剪切力,微囊化对单克隆抗体,干扰素等有用产品的大规模生产提供有效途径.,优点

12、：,微囊用一种人造的半透膜制成的多孔微球体，小分子 物质可以自由透过，而各种酶、辅酶、离子交换 剂、活性炭及蛋白等大分子物质包裹在其中不能 逸出，利用它们催化反应底物。,2.7 动物细胞的大规模培养,成功例子：,杂交瘤细胞 胰岛细胞,2.7 动物细胞的大规模培养,本世纪80年代初，LimSum制成了细胞能在其中生长繁殖的微囊。如图1-3所示，制备动物细胞微囊所用的材料，主要是海藻酸(ALG)，和多聚赖氨酸(PLL)，海藻酸是以1,4-键联接的多聚甘露糖醛酸和古罗糖醛酸，此两者的不同比例及海藻酸本身的纯度、粘度都是影响微囊形成的重要条件。赖氨酸分子量的大小(通常在40，00080，000之间)，其溶液的浓度及与海藻酸钠球混合的时间，溶液的pH，温度等都会影响微囊膜孔径的大小甚至影响它的半渗透作用。,2.7 动物细胞的大规模培养,2.7 动物细胞的大规模培养,2.7 动物细胞