定量PCR介绍.ppt

1、August 23, 2020,实时荧光定量PCR介绍,宝生物工程（大连）有限公司,主 要 内 容,实时荧光定量PCR介绍,2,August 23, 2020,Real Time PCR基础知识,实时荧光定量PCR介绍,3,August 23, 2020,Real Time PCR的用途,实时荧光定量PCR介绍,4,August 23, 2020,Real Time PCR的原理,使用Real Time PCR扩增装置实时监测PCR扩增产物并进行分析的方法。,Real Time PCR,实时荧光定量PCR介绍,5,August 23, 2020,Real Time PCR的原理,同一个样品重复

2、96次PCR的扩增曲线,实时荧光定量PCR介绍,6,August 23, 2020,Real Time PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号值 达到设定的阈值时所经历的循环数。 ( C-代表Cycle，t-代表threshold）,Ct值概念,阈值：在扩增曲线的指数增长区域内适当位置上设定的 荧光检出界限。,Real Time PCR中的概念,实时荧光定量PCR介绍,7,August 23, 2020,在PCR反应体系中加入荧光物质，并实时监测荧光信号积累的整个PCR进程， 最后通过已知浓度的标准品制作的标准曲线对未知浓度的样品进行定量分析。,Real Time PCR的原理,实时荧光定量

3、PCR介绍,8,August 23, 2020,Real Time PCR检测系统-简介,实时荧光定量PCR介绍,August 23, 2020,LightCycler 480,Rotor-gene6000,MiniOpticon,Mx3005PTM,LINE-GENE FQD-66A,ABI PRISM 7500,iQ5 Real-Time PCR Detection System,TaKaRa TP800,实时荧光定量PCR介绍,August 23, 2020,各公司Real Time PCR检测系统比较,实时荧光定量PCR介绍,August 23, 2020,Real Time PCR基

4、础知识,实时荧光定量PCR介绍,12,August 23, 2020,TaqManProbe,Cycling Probe,Molecular Beacon,etc.,SYBR Green I,荧光染料嵌合法,荧光探针法,Real Time PCR的检测方法,实时荧光定量PCR介绍,13,August 23, 2020,荧光染料嵌合法（SYBR Green I）,SYBR Green I：是一种能结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的 具有绿色激发波长的染料。,SYBR Green I,实时荧光定量PCR介绍,14,August 23, 2020,F,SYBR Green I 法作用机理示意图,实

5、时荧光定量PCR介绍,15,August 23, 2020,TaqMan法作用机理,TaqMan探针为一寡核苷酸， 5 端标记一个报告基团（Reporter）， 3 端标记一个淬灭基团（Quencher）。,Q,实时荧光定量PCR介绍,16,August 23, 2020,TaqMan Probe法原理示意图,实时荧光定量PCR介绍,17,August 23, 2020,CycleavePCR法原理,Cycling probe为一寡核苷酸，一端标记一个荧光报告基 团（Reporter），一端标记一个荧光淬灭基团（Quencher）， 寡核苷酸为DNA/RNA杂合体。,RNase H,实时荧光定

6、量PCR介绍,18,August 23, 2020,CycleavePCR法原理示意图,实时荧光定量PCR介绍,19,August 23, 2020,SYBR Green I 法与Probe法比较,常用于mRNA表达量分析等,SYBR Green I 法,简便易行,价格便宜,要求反应的特异性,不能进行多重PCR,常用于SNP解析，病毒、病源菌检测,实时荧光定量PCR介绍,20,August 23, 2020,主 要 内 容,实时荧光定量PCR介绍,21,August 23, 2020,One Step和Two Step RT-PCR的选择,实时荧光定量PCR介绍,22,August 23, 2

7、020,Two-Step RT-PCR,One-Step RT-PCR,One-Step RT-PCR,One Step和Two Step RT-PCR的选择,实时荧光定量PCR介绍,23,August 23, 2020,RT Primer的选择,Random Primer Oligo dT Primer Gene Specific Primer,Random 6mer Primer,Gene Specific Primer,Oligo dT Primer,PCR R-Primer,PCR F-Primer,实时荧光定量PCR介绍,24,August 23, 2020,RT Primer的选择

8、,实时荧光定量PCR介绍,25,August 23, 2020,Total RNA中Genomic DNA混入的对策,PCR Primer,exon,intron,exon,Genomic DNA,cDNA,exon,exon,PCR Primer,Real Time PCR,Real Time RT-PCR,Small PCR Product,Small PCR Product,此种情况必须采用DNase I 处理，去除基因组DNA。,融解曲线分析,实时荧光定量PCR介绍,26,August 23, 2020,PCR Primer,exon,intron,exon,Genomic DNA,c

9、DNA,exon,exon,PCR Primer,Real Time PCR,Real Time RT-PCR,Long PCR Product or No Product,Small PCR Product,融解曲线分析,可以区分cDNA或者基因组DNA来源的扩增产物。,Total RNA中Genomic DNA混入的对策,实时荧光定量PCR介绍,27,August 23, 2020,PCR Primer,exon,intron,exon,Genomic DNA,cDNA,exon,exon,PCR Primer,Real Time PCR,Real Time RT-PCR,No Produ

10、ct,Small PCR Product,融解曲线分析,Total RNA中Genomic DNA混入的对策,实时荧光定量PCR介绍,28,August 23, 2020,Real Time PCR引物设计,目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚体要求不严格。,目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异性反应和引物二聚体要求严格。,Real Time PCR用引物与普通PCR引物设计要求不同,= 对引物设计要求严格,普通PCR引物,Real Time PCR引物,实时荧光定量PCR介绍,29,August 23, 2020,Real Time PCR引物设计原则,实时荧光定量PCR介绍

11、,30,August 23, 2020,RefSeq序列,好的引物 需要寻找好的参照序列,Real Time PCR引物设计,通过NCBI获得参考序列和相关情报。RefSeq数据库提供无重复，准确性，完整性的基因参考序列。 序列可信度高，信息量大,实时荧光定量PCR介绍,31,August 23, 2020,LOCUS NM_008777 1959 bp mRNA linear ROD 15-APR-2005 DEFINITION Mus musculus phenylalanine hydroxylase (Pah), mRNA. ACCESSION NM_008777 VERSION NM

12、_008777.1 GI:6679202 SOURCE Mus musculus (house mouse) ORGANISM Mus musculus FEATURES Location/Qualifiers gene 1.1959 /gene=Pah /db_xref=GeneID:18478 /db_xref=MGI:97473 CDS 48.1409 /gene=Pah /note=go_function: iron ion binding goid 0005506 /protein_id=NP_032803.1 /db_xref=GI:6679203 /db_xref=GeneID:

13、18478 /db_xref=MGI:97473 ORIGIN 1 aattcaaccc tgtgctaagc tagacacctc acttactgag agccagcatg gcagctgttg 61 tcctggagaa cggagtcctg agcagaaaac tctcagactt tgggcaggaa acaagttaca 121 tcgaagacaa ctccaatcaa aatggtgctg tatctctgat attctcactc aaagaggaag 181 ttggtgccct ggccaaggtc ctgcgcttat ttgaggagaa tgagatcaac ct

14、gacacaca 241 ttgaatccag accttcccgt ttaaacaaag atgagtatga gtttttcacc tatctggata 301 agcgtagcaa gcccgtcctg ggcagcatca tcaagagcct gaggaacgac attggtgcca 361 ctgtccatga gctttcccga gacaaggaaa agaacacagt gccctggttc ccaaggacca 421 ttcaggagct ggacagattc gccaatcaga ttctcagcta tggagccgaa ctggatgcag 481 accaccc

15、agg ctttaaagat cctgtgtacc gggcgagacg aaagcagttt gctgacattg 541 cctacaacta ccgccatggg cagcccattc ctcgggtgga atacacagag gaggagagga 601 agacctgggg aacggtgttc aggactctga aggccttgta taaaacacat gcctgctacg 661 agcacaacca catcttccct cttctggaaa agtactgcgg tttccgtgaa gacaacatcc 721 cgcagctgga agatgtttct cagtt

16、tctgc agacttgtac tggtttccgc ctccgtcctg 781 ttgctggctt actgtcgtct cgagatttct tgggtggcct ggccttccga gtcttccact 841 gcacacagta cattaggcat ggatctaagc ccatgtacac acctgaacct gatatctgtc 901 atgaactctt gggacatgtg cccttgtttt cagatagaag ctttgcccag ttttctcagg 961 aaattgggct tgcatcgctg ggggcacctg atgagtacat tga

17、gaaactg gccacaattt 1021 actggtttac tgtggagttt gggctttgca aggaaggaga ttctataaag gcatatggtg 1081 ctgggctctt gtcatccttt ggagaattac agtactgttt atcagacaag ccaaagctcc 1141 tgcccctgga gctagagaag acagcctgcc aggagtatac tgtcacagag ttccgacctc 1201 tgtactatgt ggccgagagt ttcaatgatg ccaaggagaa agtgaggact tttgctgc

18、ca 1261 caatcccccg gcccttctcc gttcgctatg acccctacac tcaaagggtt gaggtcctgg 1321 ataatactca gcagttgaag aatttagctg actccattaa tagtgaggtt ggaatccttt 1381 gccatgccct gcagaaaata aagtcatgaa cagaaagtga cgtcatagac agaacttagg 1441 aggtcaacca aaaaaatctg ctgatagaag tatagtaact gcttcttttc cctgaagaag 1501 aaaagttt

19、ta tttgcaatgt cagcttttaa tatattttcc taacatagtg gaggatcacc 1561 aaataaatca atttctctga atgaaagtat attaaaaccc atcagtggta gatccttcag 1621 agtcacattt gatttagata tctcagacct tcaatttggt ttaaaatgta atttctcagt,GenBank file,NM_008777,Mus musculus phenylalanine hydroxylase (Pah), mRNA.,Real Time PCR引物设计,实时荧光定量P

20、CR介绍,32,August 23, 2020,1 aattcaaccc tgtgctaagc tagacacctc acttactgag agccagcatg gcagctgttg 61 tcctggagaa cggagtcctg agcagaaaac tctcagactt tgggcaggaa acaagttaca 121 tcgaagacaa ctccaatcaa aatggtgctg tatctctgat attctcactc aaagaggaag 181 ttggtgccct ggccaaggtc ctgcgcttat ttgaggagaa tgagatcaac ctgacacaca

21、 241 ttgaatccag accttcccgt ttaaacaaag atgagtatga gtttttcacc tatctggata 301 agcgtagcaa gcccgtcctg ggcagcatca tcaagagcct gaggaacgac attggtgcca 361 ctgtccatga gctttcccga gacaaggaaa agaacacagt gccctggttc ccaaggacca 421 ttcaggagct ggacagattc gccaatcaga ttctcagcta tggagccgaa ctggatgcag 481 accacccagg cttt

22、aaagat cctgtgtacc gggcgagacg aaagcagttt gctgacattg 541 cctacaacta ccgccatggg cagcccattc ctcgggtgga atacacagag gaggagagga 601 agacctgggg aacggtgttc aggactctga aggccttgta taaaacacat gcctgctacg 661 agcacaacca catcttccct cttctggaaa agtactgcgg tttccgtgaa gacaacatcc 721 cgcagctgga agatgtttct cagtttctgc ag

23、acttgtac tggtttccgc ctccgtcctg 781 ttgctggctt actgtcgtct cgagatttct tgggtggcct ggccttccga gtcttccact 841 gcacacagta cattaggcat ggatctaagc ccatgtacac acctgaacct gatatctgtc 901 atgaactctt gggacatgtg cccttgtttt cagatagaag ctttgcccag ttttctcagg 961 aaattgggct tgcatcgctg ggggcacctg atgagtacat tgagaaactg

24、gccacaattt 1021 actggtttac tgtggagttt gggctttgca aggaaggaga ttctataaag gcatatggtg 1081 ctgggctctt gtcatccttt ggagaattac agtactgttt atcagacaag ccaaagctcc 1141 tgcccctgga gctagagaag acagcctgcc aggagtatac tgtcacagag ttccgacctc 1201 tgtactatgt ggccgagagt ttcaatgatg ccaaggagaa agtgaggact tttgctgcca 1261

25、caatcccccg gcccttctcc gttcgctatg acccctacac tcaaagggtt gaggtcctgg 1321 ataatactca gcagttgaag aatttagctg actccattaa tagtgaggtt ggaatccttt 1381 gccatgccct gcagaaaata aagtcatgaa cagaaagtga cgtcatagac agaacttagg 1441 aggtcaacca aaaaaatctg ctgatagaag tatagtaact gcttcttttc cctgaagaag 1501 aaaagtttta tttgc

26、aatgt cagcttttaa tatattttcc taacatagtg gaggatcacc 1561 aaataaatca atttctctga atgaaagtat attaaaaccc atcagtggta gatccttcag 1621 agtcacattt gatttagata tctcagacct tcaatttggt ttaaaatgta atttctcagt 1681 tctcatcaac attcatcaaa tttgggactc atatcatttg ggctctgtct gttcattttt,CCTGGCCAAGGTCCTGCG,TTGGAACCAGGGCACTGT

27、GT,AAAGCAGTTTGCTGACATTGCCTAC,TTCAGAGTCCTGAACACCGTTCC,ACTCTTGGGACATGTGCCCTTG,TCTTCTCTAGCTCCAGGGGC,AAAGTCATGAACAGAAAGTGA,GTGATCCTCCACTATGTTAG,Forward,Reverse,Real Time PCR引物设计,实时荧光定量PCR介绍,33,August 23, 2020,CCTGGCCAAGGTCCTGCG,TTGGAACCAGGGCACTGTGT,AAAGCAGTTTGCTGACATTGCCTAC,TTCAGAGTCCTGAACACCGTTCC,ACTCT

28、TGGGACATGTGCCCTTG,TCTTCTCTAGCTCCAGGGGC,AAAGTCATGAACAGAAAGTGA,GTGATCCTCCACTATGTTAG,Forward,Reverse,5-,5-,5-,5-,5-,5-,5-,5-,-3,-3,-3,-3,SNP,3 末端的T,3bp互补,Real Time PCR引物设计,实时荧光定量PCR介绍,34,August 23, 2020,Real Time PCR引物设计,31,实时荧光定量PCR介绍,35,August 23, 2020,Real Time PCR用TaqMan探针设计原则,Real Time PCR探针设计原则,实

29、时荧光定量PCR介绍,36,August 23, 2020,探针荧光标记物的选择,实时荧光定量PCR介绍,37,August 23, 2020,线性关系、扩增效率确认,检测灵敏度确认,PCR扩增效率（E）：0.8-1.2,35Cycles内可得到好的定量结果。 如果采用SYBR检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增。,相关系数（r2）：大于0.98,反应性能确认,实时荧光定量PCR介绍,38,August 23, 2020,标准Protocol 95 5 sec. 60 30 sec.,B. 有非特异性扩增时 提高退火、延伸温度 缩短退火、延伸时间 降低引物浓度,PCR条件优化顺序,实

30、时荧光定量PCR介绍,39,August 23, 2020,主 要 内 容,实时荧光定量PCR介绍,40,August 23, 2020,标准曲线制作,扩增曲线,标准曲线,标准品梯度的选择：56个梯度 标准品稀释倍数的选择：标准品稀释倍数通常为5-10,105 104 103 102 101 100,105 104 103 102 101 100,实时荧光定量PCR介绍,41,August 23, 2020,标准品的种类,实时荧光定量PCR介绍,42,August 23, 2020,质粒标准品的构建,紫色 部分为Real Time引物区,红色 部分为标准品构建用引物区,质粒标准品引物设计,AG

31、TACCTAGATCCTAG,AGTACCTAGATCCTAG,实时荧光定量PCR介绍,43,August 23, 2020,质粒标准品构建流程,基因组DNA,PCR,目的基因克隆,目的基因,目的基因,目的基因,质粒,质粒提取，OD值定量。将质粒梯度稀释至105-101 copies/ul，作为标准品。,实时荧光定量PCR介绍,44,August 23, 2020,RNA标准品构建,紫色部分为Real Time引物区,红色部分为标准品构建用引物区,蓝色部分T7启动子和Poly(T),实时荧光定量PCR介绍,45,August 23, 2020,体外转录RNA标准品构建流程,RNA纯化后，测OD

32、定量。将RNA梯度稀释至105-101 copies/ul，作为标准品。,T7 RNA polymerase,体外转录RNA,Total RNA,PCR,cDNA,RT,T7 Promoter,TTTTT,PCR产物,目的基因,目的基因,目的基因,AAAAA,AAAAA,实时荧光定量PCR介绍,46,August 23, 2020,理想的标准品扩增曲线,基线平整 Negative Control为水平线 指数区较明显，陡度大 平台区汇于一起 线性范围宽,实时荧光定量PCR介绍,47,August 23, 2020,理想的标准曲线,相关系数（r2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。 扩增

33、效率（E）：0.8-1.2，越接近1，越理想。,扩增效率,相关系数,扩增效率（E）计算方法,标准曲线X轴表示起始模板浓度（log10)，Y轴表示Ct值时 E=10-1/a-1 标准曲线X轴表示Ct值，Y轴表示起始模板浓度（log10) E=10-a-1,实时荧光定量PCR介绍,48,August 23, 2020,Real Time PCR解析方法,实时荧光定量PCR介绍,49,August 23, 2020,融解曲线分析,Tm值是指双链DNA分子解链一半时的温度。,SYBR Green I 法进行检出时， 要根据融解曲线确认PCR产物的特异性。,实时荧光定量PCR介绍,50,August 2

34、3, 2020,特异性产物,非特异产物,引物二聚体,对PCR产物特异性进行分析,融解曲线分析,实时荧光定量PCR介绍,51,August 23, 2020,Real Time PCR解析方法,实时荧光定量PCR介绍,52,August 23, 2020,绝对定量解析方法,提取样品,引物设计,标准品制备,Real Time PCR反应,数据分析,流 程,实时荧光定量PCR介绍,53,August 23, 2020,绝对定量解析方法,通过制作标准曲线来确定样品的初始模板拷贝数或浓度。通常应用于病毒、细菌、衣原体、支原体的定量检测及转基因食品的检测。,105,104,103,101,扩增曲线图,标准

35、曲线图,检测样品,检测样品,102,实时荧光定量PCR介绍,54,August 23, 2020,相对定量解析方法,以上条件不可能同时得到满足，必须用内对照基因（管家基因）校正， 进行相对表达量分析。,进行相对表达量分析必要性,实际上目的基因表达量分析,实时荧光定量PCR介绍,55,August 23, 2020,相对定量解析方法,管家基因 维持细胞基本代谢活动所必须的基因, 如：GAPDH、-actin等。,筛选方法,根据文献提供 通过具体实验筛选,实时荧光定量PCR介绍,56,August 23, 2020,相对定量解析方法,通过标准曲线对对照样品、检测样品的目的基因及管家基因进行定量，然

36、后以管家 基因的定量结果为依据对目的基因进行比值校正，求得相对值即为相对表达量。,相对值=,校正值=,目的基因定量结果,管家基因定量结果,检测样品的校正值,对照样品的校正值,通过对照样品、检测样品的目的基因及管家基因的Ct值，然后以管家基因的Ct值为 依据对目的基因进行差值校正，最终求得相对表达量。,双标准曲线法,Ct法,相对值 = 2,-Ct (目检-管检) -Ct (目对-管对),实时荧光定量PCR介绍,57,August 23, 2020,主 要 内 容,实时荧光定量PCR介绍,58,August 23, 2020,定性分析应用例 对人的ALDH2基因进行SNP解析,实时荧光定量PCR介

37、绍,59,August 23, 2020,SNP解析原理示意图,实时荧光定量PCR介绍,60,August 23, 2020,Cycling Probe法,PCR-RFLP法,ROX,FAM,ROX、FAM通道均有信号检出,Eco57 I CTGAAG(N)16 GACTTC(N)14 wild type :切断 Mutant type :不切断,ROX,FAM,Mutant,wild,ROX通道有信号检出,FAM 通道检出荧光信号,ROX,FAM,杂合型 (hetero),野生型 (wild homo),突变型 (mutant homo),定性分析应用例 对人的ALDH2基因进行SNP解析,

38、实时荧光定量PCR介绍,61,August 23, 2020,定性分析应用例 对人的ALDH2基因进行SNP解析,提取样品,引物、探针设计,Real Time PCR反应,数据分析,流 程,实时荧光定量PCR介绍,62,August 23, 2020,从人血液中（共计10个样品）提取基因组DNA。,样品提取,提取试剂：Blood Genome DNA Extraction Kit (D9081),定性分析应用例 对人的ALDH2基因进行SNP解析,定量反应,反应试剂：Cycleave PCR Core Kit (DCY501),实时荧光定量PCR介绍,63,August 23, 2020,实验

39、结果,Allele 1 : 突变型,Allele 2 : 野生型,定性分析应用例 对人的ALDH2基因进行SNP解析,Hetero : 杂合型,实时荧光定量PCR介绍,64,August 23, 2020,绝对定量应用例 对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量,检测方法 TaqMan probe 法 检测样品 3个从SARS病毒培养液中提取的Genomic RNA 目的基因 SARS病毒RNA 内 参 SARS Internal Control RNA 标 准 品 SARS Control RNA 试 剂 One Step PrimeScript RT-PCR Kit （Perfec

40、t Real Time）（DRR064） 仪 器 Smart Cycler ,实时荧光定量PCR介绍,65,August 23, 2020,pBluescript II SK(+) Vector,T7 Promoter,SARS Control RNA构建,绝对定量应用例 对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量,实时荧光定量PCR介绍,66,August 23, 2020,纯化的SARS Control RNA OD值测定结果,体外转录的SARS Control RNA 电泳照片,M1 M2,M1: -Hind digest M2: DL2,000 Marker,DNase I 处理

41、前,DNase I 处理后,绝对定量应用例 对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量,实时荧光定量PCR介绍,67,August 23, 2020,DNA,T7 Promoter,SARS Internal Control RNA的构建,pBluescriptII SK(+) Vector,绝对定量应用例 对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量,实时荧光定量PCR介绍,68,August 23, 2020,体外转录的Internal Control RNA电泳照片,M1: -Hind digest M2: DL2,000 Marker,纯化的SARS Internal Control RNA OD值测定结果,M1 M2,DNase I 处理前,DNase I 处理后,绝对定量应用例 对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量,实时荧光定量PCR介绍,69,August 23, 2020,探针的选择,绝对定量应用例 对SARS培养液中所含