DNA粗提取与鉴定实验讲解.ppt

1、1.提取生物大分子的基本思路 选用一定的 或 方法分离具有不同_ 的生物大分子。 2.提取DNA的思路：利用DNA与 、 和 等在 和 性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。,一、提取DNA的方法,物理,化学,物理或化学性质,RNA,蛋白质,脂质,物理,化学,DNA粗提取与鉴定,回扣基础知识点,3.原理 (1)DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的 溶液中溶解度不同。利用这一特点，选择适当的 就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离的目的。,NaCl,盐浓度,(2) 能水解蛋白质，但对DNA没有影响。大多数蛋白质不能忍受 的高温，而DNA在 以上才会变性。洗涤剂能瓦解 ，但对

2、DNA没有影响。 (3)DNA不溶于 ，但是细胞中的某些蛋白质则溶于此溶液。,酒精,蛋白酶,6080,80,细胞膜,4.DNA的鉴定 在 的条件下，DNA遇二苯胺会染成 。注意二苯胺试剂要 。,沸水浴,蓝色,现配现用,通常选用2 mol/LNaCl溶液溶解细胞中的_，此时杂质易沉淀；在0.14 mol/LNaCl溶液中DNA溶解度_，可使_。,DNA,最小,DNA析出,1.利用DNA的溶解特性粗提取DNA DNA与蛋白质在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。,考点一 DNA提取与鉴定原理,DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可将DNA与蛋白质进一步分离。,思考

3、：为提取到DNA，曾先后使用不同浓度的NaCl溶液，则在 质量浓度为2 mol/L NaCl溶液及0.14 mol/L NaCl溶液中应取 滤液，还是滤得的固体物？ 在质量浓度为2 mol/L NaCl溶液中DNA呈溶解状态，应取滤 液，在质量浓度为0.14 mol/L NaCl溶液中DNA溶解度极低， 易析出，应取固体物。,2.利用DNA对酶、高温及洗涤剂的耐受性提取DNA(见下表),特别提醒 (1)甲基绿可将DNA染成绿色，且不需水浴加热。二苯胺鉴定DNA属于颜色反应，需要水浴加热5 min，可使DNA呈蓝色。 (2)二苯胺试剂要现配现用，否则二苯胺会变成浅蓝色，影响鉴定效果。,归纳 DN

4、A的粗提取原理及目的归纳,1.蛋白酶能将蛋白质水解而使染色质中的DNA分离出来。下列 药品可达到上述同一目的的是() A.蒸馏水 B.NaCl溶液 C.NaOH溶液 D.盐酸 2.(2013江苏)某同学用洋葱进行DNA粗提取和鉴定实验，操作 错误的是 ( ) A.加入洗涤剂后用力进行快速、充分的研磨 B.用蛋白酶纯化过滤后的研磨液中的DNA C.加入酒精后用玻璃棒轻缓搅拌 D.加二苯胺试剂摇匀后沸水浴加热,B,A,学以致用,3.关于DNA粗提取与鉴定实验的有关说法正确的是( ) A.充分溶解DNA的盐溶液是0.14 mol/L的NaCl溶液 B.实验中提取较纯净的DNA利用了DNA不溶于酒精的

5、特点 C.对最后提取出DNA用二苯胺试剂鉴定时需用酒精灯直接加热 D.实验操作过程中先后两次加入蒸馏水的作用相同 4.下列关于DNA粗提取与鉴定的说法正确的是 ( ) A.析出DNA时要缓慢地加蒸馏水，当析出黏稠物时即不再加水 B.在探究洗涤剂对植物细胞DNA提取的影响实验中，自变量是洗涤剂和食盐 C.提取的DNA溶解后加入二苯胺试剂即可染成蓝色 D.将含有DNA的滤液放在6075的恒温水浴箱中保温后过滤，能去除蛋白质杂质,A,D,1.实验材料的选取 选用 含量相对较高的生物组织。 2.破碎细胞，获取含DNA的滤液 (1)动物细胞的破碎以鸡血为例 在鸡血细胞液中加入一定量的 ，同时用玻璃棒 搅

6、拌，过滤后收集 即可。,二、DNA粗提取实验流程,DNA,蒸馏水,滤液,(2)植物细胞的破碎以洋葱为例 先将洋葱切碎，然后加入一定量 _；进行充分 和 _，过滤后收集研磨液。,搅拌,研磨,洗涤剂和食盐,思考：用猪的血液与鸡的血液提取DNA哪个效果更好？ 用鸡的血液；因为鸡血细胞核DNA含量丰富，材料易得，而猪的红细胞无细胞核DNA含量少。,思考： 1.为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？ 蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。 2.加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？ 洗涤

7、剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。 3.在处理植物组织时需要进行研磨，其目的是什么？如果研磨不充分，会对实验结果产生什么影响？ 破碎细胞壁，使DNA更多地溶解在NaCl溶液中,研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。,3.去除滤液中的杂质 最初获得的DNA滤液含有蛋白质、脂质等杂质，需要进一步提纯DNA。具体做法如下： 方案一：滤液NaCl(2 mol/L)过滤除去杂质加入蒸馏水使NaCl溶液浓度为0.14 mol/LDNA析出过滤得到过滤物放到2

8、 mol/LNaCl溶液中溶解DNANaCl溶解液 方案二：滤液嫩肉粉(木瓜蛋白酶)静置1015 min过滤获得DNA滤液 方案三：滤液6075处理过滤获得DNA滤液 方案一的原理是_； 方案二的原理是_； 方案三的原理是_。,DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同,蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA,蛋白质和DNA的变性温度不同,思考： 1.过滤时应当选用滤纸还是尼龙布？ 选用尼龙布进行过滤 2.方案二与方案三的原理有什么不同？ 方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。 3.为什么反复地溶解

9、与析出DNA，能够去除杂质？ 用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质,4.DNA的进一步提纯 利用DNA不溶于冷却的 这一原理，可从溶液中 析出较纯净的DNA，此时DNA的状态为 。 5.DNA的鉴定 将呈丝状物的DNA溶解于5 mL质量浓度为 溶液 中，再加入4 mL的 试剂， 加热5 min， 冷却后观察溶液的颜色。注意要同时设置 实验。,酒精溶液,白色丝状物,2mol/L的NaCl,二苯胺,沸水,对照,1.实验材料的选取 本实验用鸡血细胞作实验材

10、料有两个原因：一是因为鸡血细胞 的核DNA含量丰富，材料易得；二是鸡血细胞极易吸水涨破， 而用动物肝脏细胞等作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备 要求较高，操作繁琐，历时较长。,考点二 实验设计,（1）不同生物的组织中DNA含量不同 在选取材料时，应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。 （2）材料不同所采用的提取方法不同 植物组织：取材研磨过滤沉淀。在切碎的洋葱中加入一定量的洗涤剂和食盐(洗涤剂能够溶解细胞膜)，充分搅拌和研磨，过滤后收集研磨液 鸡血：制备鸡血细胞液提取核DNA溶解细胞核内DNA析出并滤取DNADNA再溶解提取较纯净的DNA。,2.提取DNA的具体步骤, (2)溶解核内

11、DNA：滤液质量浓度为2 mol/L NaCl溶液 (3)过滤：除去不溶的杂质，得滤液 (4)析出含DNA的黏稠物：向滤液中缓缓加入蒸馏水，并用玻璃棒轻轻沿一个方向不停地搅拌，直到丝状物不再增加时，停止加水(此时NaCl质量浓度约为0.14 mol/L), (5)过滤：用多层纱布过滤，含DNA的黏稠物被留在纱布上 (6)DNA的黏稠物再溶解：将其溶解在质量浓度为2 mol/L的NaCl溶液中 (7)过滤：用两层纱布滤得含DNA的滤液 (8)对DNA进一步提纯：向滤液中加入与滤液体积相等的、冷却的体积分数为95%的酒精，静置23 min，溶液中会出现白色丝状物，即粗提取的DNA, (9)DNA的

12、鉴定,共“两次蒸馏水，三次过滤，两次析出，六次搅拌”,讨论：,两次蒸馏水 第一次：细胞吸水胀破 第二次：使 DNA黏稠物析出,此实验过程中有几次使用蒸馏水？几次过滤，几次析出，几次搅拌？分别在哪一步？,三次过滤 第一次： DNA存在于滤液里 第一步 第二次： DNA被留在纱布上 第四步 第三次： DNA存在于滤液里 第六步,过滤时使用的纱布层数与需用滤液或黏稠物有关，第二次要用其滤出的黏稠物有关，所以要使用多层纱布，第一次和第三次均要用其滤液，使用的纱布为12层,两次析出,第一次：用0.14 molL 的NaCI溶液含杂质多,第三步,第二次：用冷却的95的酒精,第七步,六次搅拌：第一、二、三、

13、五、七步,其中除第八步外，其余均要朝一个方向搅拌，在第三、五步搅动还要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，这样才能保证得到完整的DNA,讨论：实验结果不明显，可能是什么原因？,1.材料未充分研磨成糊状 2.加入酒精后振动或搅拌时过猛，DNA被破坏 3.二苯胺配制时间过长，最好现配现用，否则二苯胺会变成浅蓝色 4.析出含DNA的黏稠物中，蒸馏水不能一次快速倒入，否则会影响结果 5.实验中多个步骤要用玻璃棒进行搅拌，不同步骤中用法不同，做实验时如果不注意，会影响实验结果,特别提醒 (1)做该实验时，不能用猪血代替鸡血，因为哺乳动物成熟 的红细胞中没有细胞核，不能提取DNA。 (2)制备鸡血细胞液时，要注

14、意向鸡血中加柠檬酸钠，防止 血液凝固,静置后上层是血浆，下层为所需要的血细胞。 (3)涨破细胞的方法：向血细胞中加入蒸馏水，血细胞溶液 的浓度大于蒸馏水的浓度，从而使血细胞大量吸水而涨破。 不能用生理盐水，因为血细胞溶液的浓度与生理盐水的浓度 相当，所以血细胞在生理盐水中不能吸收水分。 (4)两次加入蒸馏水，第一次是为了使血细胞吸水涨破,释放 出核内的DNA；第二次是为了降低氯化钠的浓度，有利于DNA 的析出。 (5)两次析出DNA的方法： 第一次是加入蒸馏水，降低氯化钠的浓度，促使DNA析出； 第二次是加入冷酒精，因为DNA不溶于酒精溶液。,(6)在DNA粗提取中三次过滤时，DNA存在的部分

15、及所用的纱布层数不同： 第一次过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液，是为了得到含DNA的滤液，使用的纱布为12层。 第二次过滤含有黏稠物的NaCl溶液，是为了得到从低浓度的NaCl溶液中析出的附着在纱布上的含DNA的黏稠物，所用的纱布为多层。 第三次过滤溶解有DNA的NaCl溶液，目的是为了使DNA再溶解，所以只要用两层纱布即可。,1.(2012江苏)下列关于“DNA粗提取与鉴定实验”的叙述，正确的是 ( ) A.洗涤剂能瓦解细胞膜并增加DNA在NaCl溶液中的溶解度 B.将DNA丝状物放入二苯胺试剂中沸水浴后冷却变蓝 C.常温下菜花匀浆中有些酶类会影响DNA的提取 D.用玻棒缓慢搅拌滤液会导致DN

16、A获得量减少 2.(2011江苏)在利用鸡血进行“DNA的粗提取与鉴定”的实验中，下列相关叙述正确的是 ( ) A.用蒸馏水将NaCl溶液质量浓度调至0.14 mol/L，滤去析出物 B.调节NaCl溶液质量浓度或加入木瓜蛋白酶，都可以去除部分杂质 C.将丝状物溶解在质量浓度为2 mol/L NaCl溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色 D.用菜花替代鸡血作为实验材料，其实验操作步骤相同,C,课堂巩固,B,3.下图为“DNA粗提取和鉴定”实验的相关操作。这些操作目的正确的是(),A.是洗涤红细胞，去除血细胞表面的杂质 B.是溶解DNA，去除不溶于酒精的杂质 C.是溶解DNA，去除不溶于质量浓度为2

17、mol/L NaCl溶液的杂质 D.是稀释NaCl溶液，去除不溶于低浓度NaCl溶液的杂质,C,4.下图为“DNA的粗提取与鉴定”的实验装置，请回答下 列相关的问题。,(1)实验材料选用鸡血细胞液，而不用鸡全血，主要原因是鸡血细胞液中有较高含量的_。 (2)在图A所示的实验步骤中加蒸馏水的目的是_，通过图B所示的步骤取得滤液，再在溶液中加入质量浓度为2 mol/L的NaCl溶液的目的是_ (3)图C所示实验步骤中加蒸馏水的目的是_。,DNA,使血细胞破裂,使滤液中的DNA溶于浓NaCl溶液,使DNA析出,5.下图表示以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取与鉴定的操作程序，请分析回答下列问题：,（1）步骤一中，向鸡血细胞液中加入并