Chapter 5 nucleic acids.ppt

1、第五章 核酸(Nucleic Acids),核苷酸和核酸的共价结构,DNA的结构,DNA的序列分析,RNA的结构特征,核酸的性质,核酸的水解,核酸的历史,1869年Miescher从细胞核中分离出核素（nuclein）。,1889年Altman制备了核酸（nucleic acid）。,193040年，Kossel & Levene等确定核酸的的组分：,“四核苷酸假说”：核酸由四种核苷酸组成的单体构成的，缺乏结构方面的多样性。,DNA is transforming material （DNA 是转化物质）,Griffths transforming experiments (1928) sho

2、wed some materials inside the S strain had transferred to Live R strain 证明细胞内物质能在细胞间转化,O. T. Avery testified the transforming substance was DNA (1944) 证明转化物质是DNA,A Hershey and M Chase further testified transforming substance was DNA by infection of bacteria with T2 (1952) 进一步通过噬菌体T2 对细菌感染的试验证明转化物质是D

3、NA,Question: Please point out the biomolecules that are related to the information flow.请指出与信息流相关的生物分子,Information flow信息流,mRNA,Protein,Transcription 转录,Reverse transcription 反转录,Translation 翻译,Central dogma 中心法则,除少数病毒（RNA病毒）以RNA作为遗传物质外，多数有机体的遗传物质是DNA。,不同有机体遗传物质（信息分子）的结构差别，使得其所含蛋白质（表现分子）的种类和数量有所差别，有

4、机体表现出不同的形态结构和代谢类型。,RNA的主要作用是从DNA转录遗传信息，并指导蛋白质的合成。,5.1 核酸的组成成分（共价结构）,核酸 nucleic acid,核苷酸 nucleotide,核苷 nucleoside,磷酸 phosphate,嘌呤碱 purine base 或 嘧啶碱 pyrimidine base,（碱基 base）,核糖 ribose 或 脱氧核糖 deoxyribose,（戊糖 amyl sugar）,（一）核糖和脱氧核糖,-D-2-核糖,-D-2-脱氧核糖,O,（二）嘌呤碱和嘧啶碱,1,2,3,4,5,6,7,8,9,嘌呤,腺嘌呤 adenine,（A）,鸟嘌

5、呤 guanine,（G）,嘧啶,1,2,3,4,5,6,H,胞嘧啶 Cytosine,（C）,尿嘧啶 uracil,（U）,H,H,胸腺嘧啶 thymine,（T）,H,H,烯醇式,（三）核苷,胸 苷,尿苷,OH,假尿苷（）,（四）核苷酸,胸苷-5-磷酸,ADP (adenosine 5-diphosphate),ATP (adenosine 5-triphosphate),The high energy phosophoester bonds,各种核苷三磷酸和脱氧核苷三磷酸是体内合成RNA和DNA合成的直接原料。,在体内能量代谢中的作用：,ATP能量“货币”,UTP参加糖的互相转化与合成,

6、CTP参加磷脂的合成,GTP参加蛋白质和嘌呤的合成,第二信使cAMP,5.2 DNA的结构,（一）DNA的一级结构,因为DNA的脱氧核苷酸只在它们所携带的碱基上有区别，所以脱氧核苷酸的序列常被认为是碱基序列（base sequence)。通常碱基序列由DNA链的53方向写。DNA中有4种类型的核苷酸，有n个核苷酸组成的DNA链中可能有的不同序列总数为4n。,3,5,1,P,P,P,OH,A,T,G,pGpTpAOH,pG-T-A,pGTA,（二）DNA的双螺旋结构,1953年，Watson 和Crick 提出。,1. 双螺旋结构的主要依据,（1）Wilkins和Franklin发现不同来源的D

7、NA纤维具有相似的X射线衍射图谱。,（2）Chargaff发现DNA中A与T、C与G的数目相等。后Pauling 和Corey发现A与T生成2个氢键、C与G生成3个氢键。,（3）电位滴定证明，嘌呤与嘧啶的可解离基团由氢键连接。,2. 双螺旋结构模型要点,（1）两条多核苷酸链反向平行；右手螺旋。,（2）碱基内侧，A与T、G与C配对，分别形成3和2个氢键。,（3）双螺旋每转一周有10.5个bp，螺距3.6nm，直径2nm。,3. 双螺旋结构的稳定因素,（1）氢键（太弱）；（2）碱基堆积力（base stacking force，由芳香族碱基电子间的相互作用引起的，能形成疏水核心，是稳定DNA最重要

8、的因素；（3）离子键（减少双链间的静电斥力）。,4. DNA双螺旋的构象类型,B-DNA：92%相对湿度，接近细胞内的DNA构象，与Watson 和Crick提出的模型相似。,A-DNA：75%相对湿度，与溶液中DNA-RNA杂交分子的构象相似，推测转录时发生BA。其碱基平面倾斜20，螺距与每一转碱基对数目都有变化。,Z-DNA：主链呈锯齿型左向盘绕（左手螺旋），直径约1.8nm，螺距4.5nm，每一转含12个bp，只有小沟。B-DNA与Z-DNA的相互转换可能和基因的调控有关。,C-DNA（书中没有）：4446%相对湿度，螺距3.09nm，每转螺旋9.33个碱基对，碱基对倾斜6。可能是特定条

9、件下B-DNA和A-DNA的转化中间物。,D-DNA（书中没有）：60%相对湿度，DNA中A、T序列交替的区域。每个螺旋含8个bp，螺距2.43nm，碱基平面倾斜16。,（三）DNA的三级结构,线形分子、双链环状(dcDNA)超螺旋（DNA的拓扑学）,染色体包装,染色体包装的结构模型,多级螺旋模型 压缩倍数 7 6 40 5 （8400） DNA 核小体 螺线管 超螺线管 染色单体 2nm 10nm 30(10)nm 400nm 210m 一级包装 二级包装 三级包装 四级包装,Editors Summary,20 October 2005 The B to Z of DNA,The exis

10、tence of left-handed DNA (or Z-DNA) was reported in 1979, and marked by a Nature cover. This weeks cover story is the determination of the crystal structure of the junction between left-handed DNA and normal, right-handed DNA or B-DNA. Each time a DNA segment turns to Z-DNA, two of these BZ junction

11、s are created. Z-DNA often forms transiently during transcription and other physiological processes, then relaxes to the less energetic B form. The three-dimensional structure shows that the junction is very tight, and that a base pair is pushed out of the double helix, one base on each side of the

12、junction. This adjustment maintains the base stacking that is a major stabilizing factor. These displaced bases may be sites for DNA modification. On the cover, a molecule containing a BZ junction is shown in the centre, with Z-DNA, naturally, to the left and B-DNA to the right.,5.3 DNA序列分析,一、DNA限制性

13、内切酶 来源：细菌对侵入的噬菌体的抵抗的研究发现了DNA限制性内切酶。 类型：类型（复杂的多功能酶，既能降解DNA，又能修饰DNA）和类型（简单酶，产生粘性末端或平齐末端）。 限制性内切酶和限制性图谱：限制性片断长度多态性（Restriction fragment longth polymorphisms, RFLP）研究，可用于缺失基因的诊断和DNA指纹鉴定等。,二、目前多采用F. Sanger “链终止法”,模板,引物,GGC,GGCC,GGCCATC,C,ddCTP,GGCCA,GGCCATCGTTGA,ddATP,A,GGCCATCG,GGCCATCGTTG,G,ddGTP,GGCCA

14、T,GGCCATCGT,GGCCATCGTT,T,ddTTP,三、DNA与基因组,DNA,Transcription,RNA （mRNA、tRNA、rRNA）,Translation,Protein,基因,基因是DNA片段的核苷酸序列，DNA分子中最小的功能单位。,结构基因,调节基因,基因组,（一）DNA与基因,（二）原核生物基因组的特点,1. DNA大部分为结构基因，每个基因出现频率低。,2. 功能相关基因串联在一起，并转录在同一mRNA中（多顺反子）。,3.有基因重叠现象。,（三）真核生物基因组的特点,1. 重复序列,单拷贝序列,：在整个DNA中只出现一次或少数几次，主要为编码蛋白质的结构

15、基因。,中度重复序列,：在DNA中可重复几十次到几千次。,高度重复序列,：可重复几百万次,2. 有断裂基因,mRNA,1 872bp,内含子（intron)：基因中不为多肽编码，不在mRNA中出现。,外显子（exons）：为多肽编码的基因片段。,：由于基因中内含子的存在。,例外：组蛋白基因(histongene)和干扰素基因(interferon gene)没有内含子。,5.4 RNA的结构特征,（一）tRNA,tRNA约占RNA总量的15%，主要作用是转运氨基酸用于合成蛋白质。,tRNA分子量为4S，1965年Holley 测定AlatRNA一级结构，提出三叶草二级结构模型（四臂四环）。,主

16、要特征：1. 氨基酸臂3端有CCAOH的共有结构；2. D环上有二氢尿嘧啶（D）；3. 反密码环上的反密码子与mRNA相互作用；4. 可变环上的核苷酸数目可以变动；5. TC环含有T和；6. 含有修饰碱基和不变核苷酸；7. 倒L形的三级结构。,主要特征：1.四臂四环；2.氨基酸臂3端有CCAOH的共有结构；3.D环上有二氢尿嘧啶（D）；4.反密码环上的反密码子与mRNA相互作用；5.可变环上的核苷酸数目可以变动；6.TC环含有T和；7.含有修饰碱基和不变核苷酸。,（二）rRNA,占细胞RNA总量的80%，与蛋白质（40%）共同组成核糖体。,（三）mRNA、hnRNA与snRNA,mRNA约占细

17、胞RNA总量的5%，是蛋白质合成的模板。,真核生物mRNA的前体在核内合成，包括整个基因的内含子和外显子的转录产物，形成分子大小极不均匀的hnRNA。,snRNA主要存于细胞核中，占细胞RNA总量的0.11%，与蛋白质以RNP（核糖核酸蛋白）的形式存在，在hnRNA和rRNA的加工、细胞分裂和分化、协助细胞内物质运输、构成染色质等方面有重要作用。,（四）RNA的其它功能,1981年，Cech发现RNA的催化活性，提出核酶（ribozyme）。,大部分核酶参加RNA的加工和成熟，也有催化C-N键的合成。23SrRNA具肽酰转移酶活性。,RNA在DNA复制、转录（如snRNA）、翻译中均有一定的调

18、控作用，与某写物质的运输与定位有关。,5.5 核酸的性质,（一）一般理化性质,1.为两性电解质，通常表现为酸性。,2. DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末，不溶于有机溶剂。,3. DNA溶液的粘度极高，而RNA溶液要小得多。,4.RNA能在室温条件下被稀碱水解而DNA对碱稳定。,5.利用核糖和脱氧核糖不同的显色反应鉴定DNA与RNA。,（二）核酸的紫外吸收性质,核酸的碱基具有共轭双键，因而有紫外吸收性质，吸收峰在260nm（蛋白质的紫外吸收峰在280nm）。,核酸的光吸收值比各核苷酸光吸收值的和少3040%，当核酸变性或降解时光吸收值显著增加（增色效应），但核酸复性后，光吸收值又回复到原

19、有水平（减色效应）。,（三）核酸结构的稳定性,1.碱基对间的氢键；2.碱基堆积力；3.环境中的正离子。,（四）核酸的的变性,：双螺旋区氢键断裂，空间结构破坏，形成单链无规线团状，只涉及次级键的破坏。,DNA变性是个突变过程，类似结晶的熔解。将紫外吸收的增加量达到最大增量一半时的温度称熔解温度(melting temperature, Tm)。,Tm,Tm,影响Tm的因素：,（1）G-C的相对含量 （G+C）% =（Tm 69.3） 2.44,（2）介质离子强度低，Tm低。,（3）高pH下碱基广泛去质子而丧失形成氢键的能力。,（4）变性剂如甲酰胺、尿素、甲醛等破坏氢键，妨碍碱基堆积，使Tm下降。

20、,（五）核酸的复性（退火）,：变性核酸的互补链在适当条件下重新缔合成双螺旋的过程。,影响复性速度的因素：C0t1/2=1/k,（1）单链片段浓度,（2）单链片段的大小,（3）片段内重复序列的多少,（4）溶液离子强度的大小,（5）溶液温度的高低 （T 25）,（六）分子杂交,：在退火条件下，不同来源的DNA互补区形成氢键，或DNA单链和RNA链的互补区形成DNA-RNA杂合双链的过程。,探针：用放射性同位素或荧光标记的DNA或RNA片段。,原位杂交技术：直接用探针与菌落或组织细胞中的核酸杂交，未改变核酸所在的位置。,点杂交：将核酸直接点在膜上，再与核酸杂交。,Southern印迹法：将电泳分离后的DNA片段从凝胶转移到硝酸纤维素膜上，再进行杂交。,Northern印迹法：将电泳分离后的RNA吸印到纤维素膜上再进行分子杂交。,5.6 核酸的水解,一、核酸的酸水解和碱水解,酸水解：RNA对稀酸不敏感，但DNA对稀酸敏感，嘌呤碱基连接的C-N键容易被酸解，生成脱嘌呤酸。 碱水解：RNA碱水解产物中含有2/核苷酸；DNA很难被碱水解。,二、核酸的酶水解,核酸酶（Nucleases）：能水解核酸的酶。（核酶？） 两种类型：a型内切酶：水解发生在磷酸基3/端，产物是5/核苷酸，如DNases和蛇毒磷酸二酯酶