第四章 HPLC.ppt

1、第四章 高效液相色谱 4.1 概述 4.2 HPLC仪器 包括： 高压输液装置; 进样系统; 分离系统; 检测系统;辅助系统 4.3 流动相和固定相简介 4.4 高效液相色谱方法各论 分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱 4.5 应用注意事项,4.1 概述 高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱方法。按照固定相不同可分为：液液分配色谱；吸附色谱(液固色谱)；离子交换色谱；尺寸排阻色谱(凝胶渗透色谱)。此外，还有亲和色谱、平板色谱(薄层色谱)等。 早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在直径15cm, 长50500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，填

2、充的固定相颗粒直径多在150200m范围内。即使这样，流速仍然很低(1mL/min)，分析时间仍然很长！ 当加压增加流速(真空或空气泵)时，尽管分析时间减少，但柱塔板高度Hmin也相应增加了！或者说柱效下降了。 为了解决分析时间及柱效问题，人们认识到：最为有效地增加柱效的唯一方法是减小填充物的粒径（310 m ）！ 直到60年代，由于在高压下操作的液压设备、高效固定相以及高灵敏检测器的出现及发展，才彻底解决了分析时间及柱效的问题。即所谓的高效液相色谱技术才真正得到广泛应用。,1. 高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较 高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，只需数分钟；而经典

3、方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。 高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。 高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV10-9g, 荧光检测器10-11g。 2. HPLC与GC的比较 分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而这些物质只点有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。 流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合，可供选择的机会多。它除了起运载作用外，还可与

4、组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。 操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。 结论：从色谱分析的发展来看，HPLC比GC更为有用、更具发展前途！,3. 应用 由于HPLC分离分析的高灵敏度、定量的准确性、适于非挥发性和热不稳定组分的分析，因此，在工业、科学研究，尤其是在生物学和医学等方面应用极为广泛。如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等分析，大多是通过HPLC来完成的。 右图是各种HPLC方法的应用范围及对象,极性增加,不溶于水,溶于水,非极性,离子,非离子极性,吸附

5、,反向分配,分配,正向分配,离子交换,尺寸排阻,凝胶渗透,凝胶过滤,分 子 量,4.2 HPLC仪器 HPLC仪器包括： 高压输液装置; 进样系统; 分离系统; 检测系统; 此外还配有梯度淋洗、自动进样和数据处理装置。 其工作过程如图所示。,HPLC仪器详解,1. 高压输液系统 1）贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金)，其孔很约2 m，可防止颗粒物进入泵内。 2）脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去（气泡会影响检测）。 3）高压泵： 对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。 输液泵种类：恒压型和

6、恒流型。 恒压泵(类似于风箱)可迅速获得高压，适于柱的匀浆填充。但因泵腔体积大，在往复推动时，会引起脉动，且输出流量随色谱系统阻力（主要是柱填充物）变化而变化，现已较少使用。 恒流型溶剂流量恒定，与柱填充情况无关，使用较多。有机械注射式和机械往复式两种。应用最多的是机械往复式恒流泵(见下图。每分钟往复25100次，因此脉动小。对流量变化敏感的检测器也会有噪声干扰，此时可连接一脉动阻尼器)。,4）梯度淋洗装置：在分离过程中逐渐改变流动相组成的装置。如果只有一个泵，可采用低压混合设计（将两种或以上的溶剂按一定比例混合，再由高压泵输出）；如果有两个或以上泵，调节各自的流量，在高压下混合。,2. 进样

7、系统 与GC相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱本身所产生的峰形展宽相对要小些。即，HPLC的展宽多因一些柱外因素引起。这些因素包括：进样系统、连接管道及检测器的死体积。进样装置包括两种。 1）隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装置简单、死体积小。但进样量小且重现性差。 2）高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好，如图。,3. 色谱柱 1）对色谱柱的要求：内壁光滑的优质不锈钢柱，柱接头的死体积尽可能小。柱长多为1030cm，内径为45mm(尺寸排阻色谱柱常大于5mm，制备色谱柱内径更大)； 2）柱的填充：主要采用匀浆法。根据使用匀浆试剂的性质不同可分

8、为： 平衡密度法： 使溶剂密度和填充颗粒密度相近，此时颗粒沉降速度趋于0。常用的匀浆试剂有四氯乙烯、四溴乙烷和二碘甲烷等； 非平衡密度法： 采用粘度较大的试剂，如CCl4，CH3OH, 丙酮，二氧杂环已烷、THF等。 填充方法： 填充时，按上述方法制作匀浆液，用流动相充满色谱柱及其延长管中，然后将匀浆液倒入匀浆填充器，在较高压力下迅速将其注入色谱柱内。要求填充速度快(防凝聚、沉降或结块)、且无空气进入(影响填充均匀性)。,4. 检测系统,检测器 液相色谱检测器包括紫外吸收、荧光发射、示差折光和安培检测器等。 1）紫外检测器 其检测原理和UV-Vis方法一样。只是此时所采用的吸收池为微量吸收池，

9、通常其光程为2-10mm, 体积约为110 L。 HPLC分析中，约有80%的物质可以在254 nm或280nm处产生紫外吸收。因此该类检测器应用很广。 在选择测量波长时注意：溶剂必须能让所选择的光透过，即所选波长不能小于溶剂的最低使用波长。,快速扫描光电二极管阵列（PDA）检测所获得的三维色谱-光谱图,4）安培检测器 由恒电位仪和一薄层反应池（体积为15L）组成。如图。 该检测器是利用待测物流入反应池时在工作电极表面发生氧化或还原反应，两电极间就有电流通过，此电流大小与待测物浓度成正比。 采用安培检测器时，流动相必须含有电解质，且呈化学隋性。它最适于与反相色谱匹配。但此检测器只能检测具有电活

10、性的物质。,5）电导检测器 电导检测器主要用于离子色谱的检测。 其原理是基于待测物在一些介质中电离后所产生的电导（电阻的倒数）变化来测量电离物质的含量。 电导检测器的主要部件是电导池。其响应受温度影响较大，因此需要将电导池置于恒温箱中。另外，当pH7时，该检测器不够灵敏。 其它检测器还包括：MS、IR、Evaporative light scattering detector(光散射)、极谱等。,4.3 HPLC流动相和固定相简介 一、流动相 与GC流动相不同，HPLC流动相为溶剂，它既有运载作用，又和固定相一样，参予对组分的竞争，因此溶剂的选择对分离十分重要。 理想的溶剂应有下列特性： 1）

11、对待测物具一定极性和选择性； 2）使用UV检测器时，溶剂截止波长要小于测量波长(为什么？) ；使用折光率检 测器，溶剂的折光率要与待测物的折光率有较大差别； 3）高纯度。否则基线不稳或产生杂峰，同时可使截止波长增加； 4）化学稳定性好； 5）适宜的粘度。粘度过高，柱压增加；过低，易产生气泡。 二、固定相载体 由于各种HPLC分离方法的流动相均为液体，因此，HPLC通常是按照固定相载体或固定液的不同来分类的。,1. 按承受压力分 刚性固体：SiO2为基质，耐压为7.01081.0109 Pa。可制成直径、形状和孔隙 深度不同的颗粒；主要用于吸附、分配和键合色谱； 硬 胶：以聚合物为基质(常用苯乙

12、烯与二乙烯苯交联而成)，耐压上限为3.5 108 Pa, 主要用于离子交换和尺寸排阻色谱。 2. 按孔隙深度分 表面多孔型：以实心玻璃珠为基体，在基体表面覆盖一层多孔活性材料(如硅胶、 氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等)。表面多孔型固定相的 颗粒大(易装柱)、多孔层厚度小且孔浅(渗透性好，出峰快)；但交 换容量小。适于常规分离分析。 全多孔型：全部由硅胶或氧化铝微粒聚集而成，因颗粒极细，因而孔径小、传 质快、 柱效高。特别适于复杂混合物的分离。 3. 按分离原理分： 分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱等,4.4 高效液相色谱方法各论 按分离原理可将HPLC分为分配色谱

13、、吸附色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱等。,一、吸附色谱的分离机理,随着样品在固定相上的吸附能力由大到小 在色谱柱上的保留由长到短,吸附色谱概述,分离基于样品的极性差异。 洗脱次序一般为正相，即：极性低的先被洗脱 常用的流动相 非极性有机溶剂，如己烷 乙酸等为添加剂 常用固定相 硅胶、氧化铝、羟基磷灰石等。,二、分配色谱的分离机理,分配色谱概述,反相色谱的主要类型，基于分子的极性分离 洗脱次序：一般为反相，即极性高的先被洗脱 常用的流动相： 有机溶剂如甲醇、乙腈，水 应用添加剂，成为离子对、离子抑制方法 常用固定相： 碳十八、碳八、胺基等基团 反相色谱固定相多为键合相?,键合相色谱柱

14、,以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基等基团联在基质上，作为固定相。 优点 固定相稳定，不易流失 应用广泛，可使用多种溶剂 消除硅羟基的不良影响 缺点 pH值不能小于3 同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同,1. 原理： 根据各待测物在互不相溶的两溶液中的溶解度不同，因而具有不同的分配系数。在色谱柱中，随着流动相的移动，这种分配平衡需进行多次，造成各待测物的迁移速率不同，从而实现分离的过程。 2. 流动相: HPLC分析中，为防止固定相的流失，流动相与固定液应尽量不互溶，或者说二者的极性相差越大越好。因此，根据流动相与固定相极性的差别程度，可将液液色谱分为正相分配色谱（流动相极性小于

15、固定相极性，极性小的先流出，适于极性组分分离）和反相分配色谱（流动相极性大于固定相极性，极性大的先流出，适于非极性组分分离）。,3. 固定相 原则上，用于GC的固定相也可用于HPLC作固定相。但HPLC固定液易流失，因此常用的只有几种，按极性由高到低为：,-氧二丙腈(ODPN)、聚乙二醇(PEM)、三甲撑二醇(TMG)、十八烷(C18)、角鲨烷(SQ)。 根据涂渍方法的不同，可将固定相分为机械涂渍型和化学键合型，后者应用更为广泛。 1）机械涂渍固定相：将固定液通过机械混合的方法涂渍到表面多孔型(0.5-1.5%涂布量)或全多孔型载体(5-10%涂布量)上形成的液液色谱固定相。该种固定相最大的不

16、足是固定液易流失、分离稳定性及重现性差，不适合梯度淋洗。 为减少固定液的流失，通常在柱前加一根很短的前置柱，该柱涂有与分析柱相同但有更高含量的固定液，使流动相进入分析柱之前，预先被固定液饱和。,4. 正相和反相键合色谱法 正相键合色谱中，随流动相极性增加，组分分配比k增加。 在HPLC分析中，有时要在流动相中加入适量的盐(碳酸铵、四烷基铵盐)或酸，为什么？答：都是为了防止峰形拖尾。加入盐类是为了减少待测物与键合相表面的残留硅醇基作用；加入酸是抑制酸类待测物的离解，使其以游离酸在柱内分离。 何为正相色谱，何为反相色谱？,三、离子交换色谱 此法是利用离子交换原理和液相色谱技术相结合，测定各类阴、阳

17、离子的分离分析方法。它既适于无机离子，也适于有机物分离，如蛋白质、氨基酸、核酸等。 1. 原理：利用不同待测离子对固定相的亲和能力（或离子交换能力）的差别来实现分离的。待测离子与离子交换树脂固定相上带电荷基团或游离的离子发生可逆交换反应： 对阳离子，滞留顺序为： Fe3+, Ba2+, Pb2+, Sr2+, Ca2+, Ni2+, Cd2+, Cu2+, Co2+, Zn2+, Mg2+, UO22+, Tl+, Ag+, Cs+, Rb+, K+, NH4+, Na+, H+, Li+ 对阴离子，滞留顺序为：柠檬酸根, SO42-, C2O4, I-, HSO4-, NO3-, CrO42

18、-, Br-, SCN-, Cl-, HCOO-, CH3COO-, OH-, F- 思考：待测阳离子电荷越小、其水合离子的半径越大，则越先出峰？对吗？,离子交换树脂的分离机理,离子交换色谱概述,适用于离子型化合物的分离 分离基于离子的带电特性 洗脱次序受多种因素的影响 填料（离子交换树脂）的种类阴/阳，强/弱，交换基团 样品分子特性 盐的种类、浓度 温度及pH值 有机溶剂,离子交换树脂的交换容量,2. 固定相 按离子交换剂类型分四种： 按固定相制作方法可分为： 多孔型离子交换树脂(包括微孔型和大孔型)； 表面多孔型(包括薄膜型）离子交换树脂； 离子交换键合型。,3. 流动相 离子交换色谱流动

19、相为盐类缓冲溶液(有一定pH和离子强度) ，通过改变pH、缓冲剂类型、离子强度、加入有机试剂和配位剂等条件来控制分配比k，改变交换剂的选择性，进而影响样品待测物的分离。 pH值：影响酸或碱的离解平衡，控制组分离子形式所占的分数。当组分以分子形式存在时，则不被保留；离子分数越高，保留值越大。常用的有柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐和氨水等。 离子强度I：对保留值的影响比pH更大。组分保留值受流动相中盐类总浓度控制。增加外加阴或阳离子将增加它们对R+或R-的竞争能力，使组分保留值减小。通过加入不同种类的盐，可影响柱的选择性，因为不同物质对交换剂的亲和能力不同。 有机溶剂：外加有机溶剂通常减小组分的

20、保留值。其极性越小，保留值越小。常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、乙腈和二氧杂环已烷等。 配离子L：当大量L、组分X随流动相进入柱后，发生配位剂交换： RM-L+X RM-X+L 该法用于分离各种氨基酸或碱类。 思考：离子交换色谱法中，流动相常以无机盐的缓冲液为流动相。请问缓冲液的pH值及离子强度对分离各有何影响？,四、离子色谱 离子色谱(IC)是70年代发展的新方法。其分离原理与离子交换色谱原理一样，只是流出的各种离子用电导检测器检测。但由于流动相都是强电解质，其电导率比待测离子约高2个数量级，这种强背景电导会完全掩盖待测离子信号。 为解决此问题，1975年Small 提出，在离子交换柱之后，再串

21、结一根抑制柱。该柱装填与分离柱电荷完全相反的离子交换树脂。通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变为低背景电导的流动相，从而可用电导检测器检测各种离子的含量。 例如：分析阳离子时，以无机酸为流动相，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换树脂，则发生下列反应： R+OH + HCl(流动相)R+Cl- + H2O R+OH + MCl(待测物) R+Cl + M+OH- 可见，不仅大量酸转化为低电导的水，而且待测离子转化为具有更大淌度的碱。 该法的不足之处在于：抑制柱要定期再生、谱峰在经过抑制柱后会展宽，降低分离度。因此有人提出了使用电导率很低的溶液(如苯甲酸盐稀溶液)作流动相。

22、思考：IC分离中，何为抑制柱？分析阴离子时，抑制柱中应填充何种离子交换树脂？,五、离子对色谱法（IPC） 离子对色谱主要用来分离强极性有机酸和有机碱。 1. 原理：将与待测物离子A电荷相反的离子B（称为对离子或反离子）加入到流动相（常为有机相）中，使待测离子A与对离子B形成离子对AB，该AB离子对的性质与A离子或B离子的性质不同，即间接改变了待测离子的保留特性。 例如：固定相为非极性键合相，流动相为水溶液，于流动相中加入与待测离子A-有相反电荷的离子B+： 由于离子对AB具有疏水性，因而被非极性固定相提取。其它待测离子A1，A2，A3.因与B离子间的成对能力不同，而形成不同疏水性的离子对，使得

23、各待测物在柱内的保留值不同，从而达到分离的目的。 思考：有一强极性有机酸混合物，若用离子对色谱法分离，请问在流动相中应加入阴离子还是阳离子来开成离子对？,六、体积排阻色谱法 体积排阻色谱又称凝胶(渗透)色谱，主要用于大分子的分子分离。它是基于待测物分子的尺寸和形状不同来实现分离的。 1. 分离原理：固定相为化学惰性的多孔凝胶，它类似于分子筛，但孔径更大。凝胶内有一定大小的空穴，分子体积大的待测物不能渗入孔穴中而被排阻，较早地被淋洗出来，中等的部分渗透，小分子则完全渗透，最后流出色谱柱。即待测物分子按分子大小(分子量大小)先后从柱中流出。 2. 固定相 3. 流动相的要求：能溶解样品且与凝胶相似

24、(润湿凝胶)、粘度小(增加扩散速度)。,体积排除色谱的分离机理,凝胶色谱概述,凝胶渗透（GPC）、凝胶过滤（GFC） 分离基于分子在溶液中的体积大小 洗脱次序：大分子先被洗脱 流动相不参与分离，只起溶剂作用 分离效率低 色谱行为容易预测,七、亲合色谱 主要用于生物大分子与固定相之间的特异亲合力进行选择性分离及纯化的方法。 分离原理：于载体表面先键合具有一般反应性能的环氧或联氨（称为间隔臂），然后再连接上配基，如酶、抗原或激素。 当含有复杂混合试样的流动相流经这种经固定化的配基时，其中具有亲合力特性的生物大分子与配基相互作用而被保留，无此作用的则被洗出；随后，改变流动相pH或组成，再将被保留的大

25、分子组分以纯品的形式洗脱出来。 特点：选择性过滤、纯化效果好。,液相色谱柱及分离机理的关系,从色谱方法上分 正相 / 反相 离子交换 分子体积排除 亲合 疏水回受,从柱子类型上分 分配 / 吸附 离子交换 凝胶 亲合,色谱柱化学及外形结构的关系,七 色谱分离方法的选择,要正确地选择色谱分离方法，首先必须尽可能多的 了解样品的有关性质，其次必须熟悉各种色谱方法的主要特点及其应用范围。 选择色谱分离方法的主要根据 是样品的相对分子质量的大小，在水中和有机溶剂中的溶解度，极性和稳定程度以及化学结构等物理、化学性质。 一、相对分子质量 对于相对分子质量较低（一般在200以下），挥发性比较好，加热又不易

26、分解的样品，可以选择气相色谱法进行分析。相对分子质量在200 2000的化合物，可用液固吸附、液-液分配和离子交换色谱法。相对分子质量高于2000，则可用空间排阻色谱法。,七 色谱分离方法的选择,二、溶解度 弄清样品在水、异辛烷、苯、四氯化碳、异丙醇中的溶解度是很有用的。水溶性样品最好用离子交换色谱法和液液分配色谱法；微溶于水，但在酸或碱存在下能很好电离的化合物，也可用离子交换色谱法；如样品可溶于烃类（如苯或异辛烷），（油溶性样品或相对非极性的混合物），则可采用液一固吸附色谱；如样品溶解于四氯化碳，则多采用常规的分配和吸附色谱分离；如样品既溶于水又溶于异丙醇时，常用水和异丙醇的混合液作液一液分

27、配色谱的流动相，以憎水性化合物作固定相。,七 色谱分离方法的选择,三、化学结构 用红外光谱法，可预先简单地判断样品中存在什么官能团。然后，确定采用什么方法合适。 若样品中包含离子型或可离子化的化合物，或者能与离子型化合物相互作用的化合物（例如配位体及有机螯合剂），可首先考虑用离子交换色谱，但空间排阻和液液分配色谱也都能顺利地应用于离子化合物；异构体的分离可用液固色谱法；具有不同官能团的化合物、同系物可用液液分配色谱法；对于高分子聚合物，可用空间排阻色谱法。现列出表作为选择分离类型的参考。,表 液相色谱分离类型选择参考表 溶于水排阻色谱，水为流动相 相对分子质量 2000 不溶于水排阻色谱，非水

28、流动相 同系物分配色谱 不溶于水 异构体吸附色谱 样品 分子大小差异排阻色谱 反相液一液色谱 相对分子质量 溶于水，不离解 2000 排阻色谱，水为流动相 碱阳离子交换色谱 溶于水，可离解 酸阴离子交换色谱 溶于水,离子与非离子反相离子对色谱,八、实际应用过程注意事项,1. 选HPLC参数时的基本考虑 溶解度 - 选择流动相的条件 分子量 - 在样品预处理或GPC分析时有用 官能团 - 有否离子化基团? 保留特性如何? 样品的基质 - 考虑如何前处理 在基质中样品的含量 - 分析、制备都考虑 检测特性 - 有否紫外吸收? 荧光? 找出样品中不同组份之间的差异 摸索条件的重要线索,极性问题,2.

29、 对HPLC柱的了解,平均颗粒度，颗粒度分布 颗粒度(dp) 颗粒度越小：柱效越高(传质好，涡流扩散小) 柱压越高(渗透性差) 颗粒分布 颗粒分布越宽柱效低(渗透性差) 颗粒形状 球型柱效高、重现性好、柱床结构均匀 无定型：柱床结构不均匀 流动相线性速度不均匀 谱带扩展,对HPLC柱的了解（二）,平均孔径/孔体积 孔径/孔体积分布 大的孔径可分析高分子量的分子,对HPLC柱的了解（三）,键合相化学 影响化合物的分离度：a 不同键合相对不同种类的化合物分离不同 可能导致色谱的分离机理不同 如：C18、C8、CN,对HPLC柱的了解（四）,含碳量 含碳量越高，k值越大（固定相传质效应增加） 高含碳

30、量 有利于不易保留的化合物的分离 水解稳定性好，重现性好 有利于极性化合物的拖尾改善 低含碳量 有利于分析中性及碱性化合物 降低溶剂损耗,不同色谱柱的含碳量,色谱柱C% k苊 (50/50的乙腈/水) Symmetry C181917 Zorbax ODS1715.7 LiChrosorb RP-181510.3 Symmetry C81212.5 Resolve C-181212.4 Ultrasphere ODS1111.3 Partisil ODS-31112.0 mBondpak C-1810 7.9 Nova-Pak C-18 7 5.5,对HPLC柱的了解(五),填料的端基封口 封

31、口残余硅羟基 减少不可逆吸附或拖尾 增加碳含量（0.1% - 1%）,残基处理的效果,NovaPak C18,未封口 C18, 抗坏血酸 烟酰胺 对氨基苯甲酸 哌咯西叮 核黄素 苯酚 盐酸硫胺,对HPLC柱的了解（六）,硅胶的活性 主要影响碱性化合物的保留行为：k 生产硅胶时处理温度不同，硅胶活性也不同 是选择性差异的主要来源 硅胶的杂质含量 重金属含量低，硅羟基活性小，拖尾减小 是色谱柱质量好坏的重要标志,对HPLC柱的了解（七）,填料的稳定性 硅胶填料 pH：2-8 聚合物填料 pH：2-12 pH值小于2时键合相水解,新一代硅胶基质的色谱柱,Symmetry 高纯度硅胶：Fe，Al，Mg

32、等均10ppm 孔径100A，5m球形颗粒，端基封口 超高含碳量：C18/19%，C8/12% 表面积：300 m2/g 孔体积：1mL/g 特点 好峰形，好重现性，不同的选择性，使用寿命长,Waters聚合物基质的反相柱,特殊设计的多孔聚合物胶 有很宽的 pH 适应范围（2-12） 可用离子抑制方法分析碱性化合物 有非常不同的选择性 柱效及韧性比相应的硅胶柱低 色谱机理不太清楚 文献背景低，用户少,色谱柱的规格,内径 检测的灵敏度 样品的容量 长度 分离度，理论塔板数 速度 样品的容量 检测的灵敏度,色谱柱的清洗,对所做的样品要有充分的了解 用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗 硅胶柱的一般方

33、法 先用甲醇洗去极性杂质 用干燥的二氯甲烷、正庚烷100200ml依次活化 键合相柱(烷基)的一般方法 20倍柱体积的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次冲洗,3. 流动相及样品的预处理,液相色谱对流动相的要求 除色谱柱对流动相对的要求外，还有 与检测器匹配 脱气 避免卤素离子（不锈钢系统） 溶剂的粘度 细菌的生长,流动相的脱气,流动相脱气的目的 使色谱泵的输液准确 输液均匀准确，并且脉动减小 保留时间及色谱峰面积的重现性提高 提高检测的性能 防止气泡引起的尖峰 基线稳定，信噪比增加 溶剂的紫外吸收本底降低 保护色谱柱 减少死体积 防止填料的氧化,流动相脱气的方法,加热 简单，如同抽真空一起使用，其效果

34、很好。但容易造成流动相组成的变化 抽真空 同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果 超声波 简单，但效果不理想。 通惰性气体（一般用氦气） 可保持连续脱气，多用于低压梯度 脱气机 可保持连续脱气，多用于低压梯度,样品的预处理,样品预处理的目的 除去微粒 减少干扰杂质 浓缩微量的组份 提高检测的灵敏度及选择性 改善分离的效果 有利于色谱柱及仪器的保护,样品的预处理重要性,占样品分析时间的比例 样品预处理所用时间远大于色谱分离的时间 占分析的消耗总成本最大 消耗大量的溶剂及其他化学品 实验的重复性及准确性最差的环节 影响实验结果好坏的最重要因素 是决定性的步骤,样品预处理常用的方法,高速离心 过

35、滤、超滤 选择性沉淀 衍生反应 液-固萃取 / 液-液萃取 Sep-Pak样品处理小柱 其他,样品预处理的过程,去除微粒,过滤 过滤膜/过滤装置 有机(0.5m)/无机(0.45m) 膜片可更换 一次性使用的膜“Cartridge” 使用方便简单，交叉污染小 有更小内径，可用于微量样品的处理 高速离心 大于：10,000g,超滤,机理 超滤是一种基于分子量分离的技术 目的 根据分子量的不同把分子、细胞及病毒等分为不同的馏份 除去小分子样品中的大分子蛋白 脱盐,选择性沉淀,常用于生化样品中除蛋白 有机溶剂 乙腈，甲醇 强酸 三氯乙酸，过氯酸 盐 50% 硫酸铵 10% TCA,样品衍生,提高检测

36、的灵敏度 增加紫外基团以增强紫外检测的灵敏度 增加荧光基团使样品用高灵敏度荧光检测器 改变分离的选择性 改变组份的基团，如： 变离子型化合物为非离子型，用反相方法分离 典型的例子 氨基酸分析,样品衍生氨基酸分析,AccQ-Tag 衍生法,浓缩样品,浓缩样品的方法 萃取/吹干 沉淀/再溶解 色谱法 液固抽提/Sep-Pak小柱,固相萃取（SPE）技术,固相萃取技术是基于同液相色谱同样技术开发的产品，分离复杂样品中的不同组份 固相萃取技术（SPE）的重要性 实验室中6080%的成本及工作量在样品制备上 加速样品的制备时间 降低样品前处理的成本 提高分析的准确性及回收率 更容易自动化 减少样品处理步骤 降低对不稳定样品的影响 提高安全性,Waters的Sep-Pak小柱,Waters专门开发了固相萃取技术（SPE） Sep-Pak小柱的应用领域 除去杂质及干扰组份 把样品分成不同极性的组分析 富集微量的组份 Sep-Pak小柱的主要种类 反相 正相 离子交换,Sep-Pak的种类,根据Sep-Pak及样品的