原核生物基因表达与调控.ppt

1、第3章 原核生物基因表达与调控,基因表达(gene expression)是指储存遗传信息的基因经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过程。 典型的基因表达是基因经过转录、翻译，产生有生物活性的蛋白质的过程。 rRNA或tRNA的基因经转录和转录后加工产生成熟的rRNA或tRNA,也是rRNA或tRNA的基因表达，因为rRNA或tRNA就具有在蛋白质翻译方面的功能。,基因组(genome)是指单倍体细胞中所包含的全部基因 的总和。,生物基因组的遗传信息并不是同时全部都表达出来的： 大肠杆菌:约4000个基因，一般情况下只有5-10%在高水平转录状态。 哺乳类: 人含有10万个基因，开放转录的约1

2、万个上下。即使蛋白质合成量比较多、基因开放比例较高的肝细胞，一般也只有不超过20%的基因处于表达状态。,基因表达的组织特异性:不同组织细胞中不仅表达的基因数量不相同，而且基因表达的强度和种类也各不相同。 基因表达的阶段特异性:一般在胚胎时期基因开放的数量最多，随着分化发展，细胞中某些基因关闭、某些基因转向开放，胚胎发育不同阶段、不同部位的细胞中开放的基因及其开放的程度不一样，合成蛋白质的种类和数量都不相同。 即使是同一个细胞，处在不同的细胞周期状态，其基因的表达和蛋白质合成的情况也不尽相同。,基因表达的特点,基因表达调控(gene regulation or gene control):任何影

3、响基因转录过程和翻译过程的开启、关闭和这两个过程速率的较为直接的因素及其作用。,第一节 细菌的转录调控 一、细菌操纵子,操纵子（operon）: 细菌基因表达和调控的单位，包括共转录到一条mRNA上的多个结构基因和这些基因转录所需的顺式作用元件，这些元件包括启动子、操作子和转录调控有关的序列。 操作子（operator，操纵基因）: 指DNA上的一个位点，阻遏物能与之结合抑制相邻启动子起始转录。,操纵子学说关于原核生物基因结构及其表达调控的学说。,顺式作用元件（cis-acting element）: 不转变为其他形式（RNA或蛋白质）而只以DNA形式在原来位置起作用的DNA序列。起作用的过程

4、称顺式作用。 反式作用因子（trans-acting factor）: 能从合成地点扩散到其它场所对其他基因的表达起调控作用的蛋白质因子（有时为RNA）。起作用的过程称反式作用。,阻遏物（repressor）: 阻止基因表达的蛋白质，可与操作子结合来阻止转录，为负调控蛋白。 激活物（activator）:促进基因转录的蛋白质 ，为正调控蛋白。 二者都是调节基因的产物。,二、阻遏物和激活物,结构基因（structural gene） 编码各类具有不同结构和功能的蛋白质和RNA的基因。 调节基因（regulator gene） 编码蛋白质或RNA来调节其他基因表达的基因。,调控蛋白上存在与DNA相

5、互作用的位点，形成螺旋-转角-螺旋（HTH）结构。,由20个氨基酸残基的小肽组成, 其中羧基端的螺旋为识别螺旋(由79个氨基酸组成), 负责识别DNA大沟的特异碱基序列； 另一个螺旋(由79个氨基酸组成),没有碱基特异性, 与DNA磷酸戊糖链骨架接触。在与DNA特异结合时, 靠蛋白质的氨基酸侧链与特异碱基对之间形成氢键、疏水键和发生静电相互作用 。,调控蛋白（调节基因的产物）的结构特点：,* 两个螺旋被一个转角隔开 * 一个螺旋起识别结合DNA的作用,正调控（positive control）: 激活物通过与启动子元件结合来激活基因的表达。 即：没有调节蛋白（激活物）存在时，结构基因是关闭的，

6、而加入调节蛋白后,结构基因的表达活性被开启。,三、正调控与负调控,负调控（negative control）: 阻遏物与操作子结合来阻止基因的表达。 即：没有调节蛋白（阻遏物）存在时，结构基因是开启的，加入这种调节蛋白后，结构基因表达活性被关闭。, 所谓“关闭”指表达水平很低。本底水平的基因表达(12个mRNA分子细胞周期) 。“开启”也常有程度的差异。,基因表达调控主要表现在以下二方面： 转录水平上的调控（transcriptional regulation）； 转录后水平上的调控（post-transcriptional regulation），包括 （1）mRNA加工成熟水平调控（dif

7、ferential processing of RNA transcrpt）； （2）翻译水平调控（differential translation of mRNA）。,第二节 负调控,一、 lac操纵子(乳糖操纵子)模型,A. lac Z、Y、A基因产物由同一条多顺反子mRNA分子所编码。 B. 该mRNA分子的启动区（P）位于阻遏基因（I）与操作子（O）之间，不能单独起始lac mRNA的合成。 C. 操作子是DNA上的一小段序列（仅为26bp），是阻遏物的结合位点。 D. 当阻遏物与操作子相结合时，lac mRNA的转录起始受到抑制。 E. 诱导物通过与阻遏物结合，改变其三维构象，使之不

8、能与操作子相结合，诱发lac mRNA的合成。,乳糖操纵子学说的内容：,大肠杆菌乳糖操纵子包括3个结构基因(lacZ、lacY和lacA)、启动子P、操作子O和调节基因I。 3个结构基因各编码一种酶： lacZ基因编码-半乳糖苷酶； lacY编码-半乳糖苷通透酶； lacA编码-半乳糖苷乙酰基转移酶。,1.乳糖操纵子（lactose operon）的结构组成,结构基因每次转录出来的一条mRNA上都带有这3个基因的转录产物。,乳糖操纵子的结构组成,The lac operon includes cis-actihng regulator elements and protein-coding s

9、tructural genes,-半乳糖苷酶：是一种-半乳糖苷键的专一水解酶，除能将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖外，还能水解其他-半乳糖苷（如苯基半乳糖苷）。 -半乳糖苷通透酶：使外界的-半乳糖苷透过大肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内。 -半乳糖苷乙酰基转移酶：把乙酰辅酶A上的乙酰基转移到-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。,异乳糖,乳糖,lac操纵子的调控区域P、O区 P区（即启动子区）：一般是从lacI基因结束到mRNA转录起始位点下游5-10bp； O区（即操作子）：位于-5+21位，该区的碱基序列有对称性(即具回文序列)，其对称轴在+11位碱基对。,Repressor and RNA polym

10、erase bind at sites that overlap around the transcription startpoint of the lac operon.,-5+21,Lac 操作子的位置,The lac operator has a symmetrical sequence. The sequence is numbered relative to the startpoint for transcription at +1.,Lac 操作子的序列特征,效应物（effector）： 能够结合于蛋白并改变其性质的小分子物质称作效应物。 诱导物：与阻遏物或激活物结合，从而启动

11、操纵子转录的效应物称作该操纵子的诱导物。 其结构通常与操纵子所表达的酶的底物的结构相同或类似。 辅阻遏物：能与阻遏物结合而阻断转录的效应物称为辅阻遏物。,2.乳糖操纵子的调控模型,1）阻遏蛋白的负调控：,当大肠杆菌在没有乳糖的环境中生存时，lac操纵子处于阻遏状态。 lacI基因在其自身的启动子Pi控制下，低水平、组成性表达产生阻遏蛋白R，每个细胞中仅维持约10个分子的阻遏蛋白。 R以四聚体形式与操作子O结合，阻碍了RNA聚合酶与启动子Plac的结合，阻止了基因的转录起动。,I,N end,C end,Lac阻遏物的结构特征,Repressor maintains the lac operon

12、 in the inactive condition by binding to the operator. The shape of the repressor is represented as a series of connected domains as revealed by its crystal structure,乳糖操纵子的阻遏状态,R的阻遏作用不是绝对的，R与O偶尔解离，使细胞中还有极低水平的半乳糖苷酶及通透酶的生成。 当有乳糖存在时，乳糖受 半乳糖苷酶的催化转变为异乳糖，与R结合，使R构象变化，R四聚体解聚成单体，失去与O的亲和力，与O解离，基因转录开放，使 半乳糖苷酶

13、在细胞内的含量可增加1000倍。这就是乳糖对lac操纵子的诱导作用。,乳糖操纵子的诱导状态,Lac阻遏物的活性控制,2） CAP- cAMP的正调控,由于Plac是弱启动子，单纯因乳糖的存在发生去阻遏使lac操纵子转录开放，还不能使细菌很好利用乳糖，必需同时有CAP- cAMP 来加强转录活性，细菌才能合成足够的酶来利用乳糖。 cAMP-CAP是一个不同于阻遏物的正调控因子，而lac操纵子的功能是在这两个相互独立的调控体系作用下实现的。,cAMP(环腺苷酸)是在腺苷酸环化酶的作用下由ATP转变而来的，在真核生物的激素调节过程中也起着十分重要的作用。 将细菌放在含葡萄糖的培养基中培养，cAMP的

14、浓度就低；相反，当培养基中无葡萄糖可供利用时,只有甘油或乳糖等不进行糖酵解途径的碳源，cAMP的浓度就会很高。,3,5-cAMP的化学结构式,细菌中有一种能与cAMP特异结合的蛋白质，叫cAMP受体蛋白 (cAMP receptor protein，CRP)。 当CRP未与cAMP结合时它是没有活性的；当cAMP浓度升高时，CRP与cAMP结合并发生空间构象的变化而活化，称为分解代谢基因激活蛋白（catabolic gene activator protein，CAP）， 能以二聚体的方式与CAP结合位点结合。,在lac操纵子的启动子Plac上游端有一段序列与Plac部分重叠的序列，能与CAP

15、特异结合，称为CAP结合位点（CAP binding site）。,CAP- cAMP复合物结合于CAP结合位点，能使此处的DNA双螺旋发生弯曲，有利于形成稳定的开放型启动子-RNA聚合酶结构。 阻遏物R则是一个抗解链蛋白，阻止形成开放结构，从而抑制RNA聚合酶的功能。,Low glucose = high cAMP,lac操纵子的强诱导既需要有乳糖的存在又需要没有葡萄糖可供利用。 因为细菌是优先利用环境中的葡萄糖，只有无葡萄糖而又有乳糖时，细菌才去充分利用乳糖。,细菌对葡萄糖以外的其他糖（如阿拉伯糖、半乳糖、麦芽糖等）的利用上也有类似于对乳糖利用的情况。 在含有编码利用阿拉伯糖的酶类基因群的

16、阿拉伯糖操纵子（ara operon）、半乳糖操纵子（gal operon）中也有CAP结合位点，CAP也起类似的正调控作用。,-半乳糖苷酶在乳糖代谢中的作用是把前者分解成葡萄糖及半乳糖。如果将葡萄糖和乳糖同时加入培养基中，大肠杆菌在耗尽外源葡萄糖之前不会诱发lac操纵子，这种现象称为葡萄糖效应（glucose effect）。,二、lac操纵子的分解代谢产物阻遏,原因：是葡萄糖的某些降解产物抑制了lac mRNA的合成，科学上把葡萄糖的这种效应称之为分解代谢产物阻遏效应（catabolite repression）。 如：某大肠杆菌突变体，它不能将葡萄糖-6-磷酸转化为下一步代谢中间物，该细

17、菌的lac基因能在葡萄糖存在时被诱导合成。,第三节 生物合成操纵子的调控,一、生物合成操纵子的几个概念,分解代谢操纵子：操纵子编码的酶参与降解化合物获得分解代谢产物和能量以构建细胞生长所需的其它分子，这类操纵子称为分解代谢操纵子或称为降解操纵子。如lac,gal,ara操纵子。 生物合成操纵子：操纵子所编码的酶催化合成细胞所需的化合物，如核苷酸、氨基酸、维生素等。,二、E.coli trp操纵子(色氨酸操纵子) trp操纵子参与生物合成，它不受葡萄糖或cAMP-CAP的调控。,1.结构, 结构基因, 末端-终止子trpt(依赖)、trpt(不依赖), 相距很远的trpR编码阻遏蛋白 其活性形式

18、为四聚体,并且只有结合trp时才有活性, 控制区域： P、O和前导区及弱化子, trpO与trpE之间的162bp的前导区可转录到mRNA中, trpO的结构,* 位于trpP内，20bp,有完美的IR（反向重复序列）序列,* trpP有正常的35和10区，10区完全在trpO内,2.阻遏调控机制,无trp时,有trp时,无活性,3.弱化作用控制-基因转录的翻译调控,通过核糖体对前导区的翻译而对后面结构基因的转录进行调控,弱化子（attenuator):Trp Operon中trpE前的一段 非结构基因的对应序列（+123+150）， 其中 包括不依赖因子的终止子，由于翻译的作用使 转录终止，

19、这段序列称为(衰减子),发现过程： 这段序列缺失增加结构基因的表达，且与阻遏蛋白无关。,弱化子调控的表现：（与阻遏蛋白的负调控结果类似）,* 无trp时，所有RNApol都能通过弱化子,* 有trp时，部分逃过阻遏蛋白监督的RNApol在弱化子 处大部分被扣留，而只有10能通过。,Trp Operon mRNA的前导序列结构 :, 下游-14aa的前导肽的ORF，其中两个相连的trp的 密码子UGG(60位) 对弱化作用的实现起重要作用, 下游长28bp的不依赖因子的终止子为弱化子的核心部分, 前面有核糖体结合位点（SD序列）,前导序列的二级结构: 决定RNApol在弱化子处是终止转录还是继续

20、转录,1和2、3和4配对, 序列1和2、3和4配对时，RNApol在3、4区的不依赖因 子的终止子处终止,其后的trpE等基因表达受到限制。,2和3配对, 序列2和3配对时，RNApol继 续转录，使前导序列后的结构 基因得以转录。,弱化子弱化控制的机制 Prok.无核膜，转录和翻译偶联 a.细胞缺少trp时，Trp-tRNATrp水 平低，核糖体停顿在两个邻 近的Trp密码子处，此时核 糖体占据序列1，此时序列4 还没转录出来，序列2和3有 机会配对，RNApol可通过弱化子。,b. 当细胞有Trp时,Trp-tRNATrp水平很高,核糖体顺利地翻译出前导肽而在终止密码子处(+70,UGA位

21、于序列1和2之间)解离。 此时,核糖体占据了序列1和部分序列2,使序列2不能有效地和序列3配对,因而序列3和4产生终止子发夹结构,转录终止 。, 实现弱化子对转录的调控关键是时间和空间上的巧妙安排,空间上：两个Trp的codon位置至关重要,时间上：核糖体停顿在两个Trp codon上时，序列4还没 转录出来，否则,这种巧妙安排的一个原因就是RNApol在转录完+90序列处时产生一次延宕给与核糖体以追赶的机会。,Prok.中弱化子（衰减子）的普遍性,许多负责氨基酸合成的操纵子都受弱化子的控制，尤其是 His 操纵子中，弱化子是唯一的调控机制。,第四节 正调控,一、ara操纵子模型 1、ara操纵子的结构基因 在葡萄糖缺乏时，阿拉伯糖是另一个可以为大肠杆菌提供碳源的五碳糖，在大肠杆菌中阿拉伯糖的降解需要3个基因： araB基因：编码核酮糖激酶 araA基因：编码L-阿拉伯糖异构酶 araD基因：编码L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶。 它们是一个基因簇，简写为araBAD。由这3种基因编码的3种酶能够把阿拉伯糖分解为大肠杆菌能够利用的五碳糖。,2、ara操纵子的结构 与araB、araA和araD这3结构基因相邻的是一个复合启动子区和一个调节基因araC，由调节基因araC合成的AraC蛋白是一个自我调节蛋白（autor