2.细胞化学术.ppt

1、,细 胞 （组 织） 化 学 技 术,发展史： 细胞化学是研究细胞显微结构和超微结构的化学组成及其定位的科学（定量）。 研究对象是生物大分子：核酸、蛋白质、酶、多糖、脂类等在细胞或组织内的结构、分布及变化，为深入阐明细胞和异常细胞的增值与分化、遗传与发生、病理和病因等提供科学依据。 1830年比利时植物学家Raspail发表论文在生理学重视用显微镜观察生化物质。 1830-1870组织化学主要用于揭示生物界中的生理现象。1880-1920随着显微镜的改进和组织细胞学染色技术的发展，组织化学的概念从生理组织学转变为显微化学。 1900-1935年细胞化学技术在病理学染色方法中的应用，丰富了显微镜

2、下证实核酸、蛋白质、酶、多糖、脂类等物质的组织化学内容。 以后发展了酶细胞化学。,20世纪50年代，电子显微镜的问世，观察细胞的超微结构。到80年代末，发展与完善了电镜细胞化学。70年代由于细胞显微分光光度法和荧光显微光度法的建立，使细胞化学的成分得以定量、形成定量细胞化学。80-90年代，流式细胞仪可对单细胞化学成分定量分析的新技术（每秒可测上万个信息）。80年代后期，创立了激光扫描共聚焦显微技术，对单个细胞进行CT分析，通过计算机进行三微立体旋转，从各角度分析细胞深层和细胞表面的各种结构。可研究活细胞和定量分析细胞内的遗传物质DNA、RNA、细胞器、酶的含量等。,基本原理： 细胞中的某种化

3、学成分和其相应的底物呈现一系列的化学反应，形成在显微镜下可见到的反应产物。对细胞内的各种成分进行定性、定位、定量研究。（特异性） 常用方法及原理： 一 金属-金属盐沉淀法原理 利用金、银、铜、铁、钴等金属化合物与细胞化学成分反应过程中生成有色沉淀。 二 偶氮偶联法原理 用人工的酶底物，在酶的作用下产生分解产物，后者与重氮盐结合，引起偶氮偶联法反应，形成不溶性偶氮色素。 三 过碘酸Schiff氏剂反应原理 四 多糖（糖原）+过碘酸醛基+Schiff氏剂紫红色化合物 显示细胞内糖类为PAS反应 显示细胞核内为Feulgen反应,五 色素形成法显示酶定位的方法 某化学物质在酶作用下在细胞局部形成色素

4、沉淀，包括四唑盐法、 联苯胺色素法、黑色素形成法等。其中四唑盐法用于定性各种氧 化还原酶、多种脱氢酶、转移酶等。 还有脱氢酶显示法、底物标记法、荧光染色与免疫荧光法、酶标抗 体法等。 具体几项细胞化学技术简介： （一）。孚尔更反应显示DNA方法(Feulgen) 用弱酸（!NHCL）水解析饱和中DNA ，打开嘌呤硷基和脱氧核糖 核酸连接的双链，释放出醛基，与Schiff试剂结合紫红色化合物。 用显微分光光度计定量分析。 （二）。甲绿派郎宁显示DNA和RNA 甲绿染DNA，派郎宁染RNA，它们并不是化学作用，而是与两种 核酸的聚合程度有关。 结果 细胞核的DNA绿色兰绿色 ，核仁和胞质的RNA呈

5、红色。 （三）。丫叮橙（AO）荧光染色显示DNA和RNA AO荧光染料与 多聚体的DNA和RNA具有亲和力。结果 细胞核的DNA亮绿色黄绿 色荧光，核仁和胞质的RNA呈红色荧光。,（四）。多糖的显示法过碘酸雪夫（Schiff）氏剂反应 多糖（糖原）+过碘酸醛基+Schiff氏剂紫红色化合物 （五）。酶的显示 1 碱性磷酸酶的显示（钙-钴法） 用磷酸脂为底物，被碱性磷酸酶水解后释放出磷酸基，在pH9。29。8条件下，磷酸基与钙形成磷酸钙（无色）+硝酸钴磷酸钴（无色）+黄色硫化胺硫化胺钴（黑色） 结果 碱性磷酸酶成浅灰、灰黄、灰黑色。色深者表示酶多。对照组无反应。,2 三磷酸腺苷酶（ATPase）

6、 ATP酶使ATPADP,释放磷酸基+硝酸铅磷酸铅（黑色） 结果 ATP酶呈棕黑色沉淀，色深者表示酶多。 对照组无反应。 3葡萄糖-6-磷酸酶显示法（G-6-Pase） 葡萄糖-6-磷酸酶作用葡萄糖-6-磷酸酶钠（钾） 释放磷酸基+硝酸铅磷酸铅（黑色） 结果 G-6-P酶呈棕黑色沉淀，色深者表示酶多。 对照组无反应。,ATPase,ATPase,ATPase,G-6-Pase,G-6-Pase,G-6-Pase,G-6-Pase,45-核苷酸酶的显示法（5-Nucleoyidase） 此酶作用于5-核苷酸、水解嘌呤核苷酸或嘧啶核苷酸第五位碳原子的磷酸分子，释放磷酸基+硝酸铅磷酸铅（黑色）。 结

7、果 5-核苷酸酶呈棕黑色沉淀，色深者表示酶多。对照组无反应。 免疫细胞化学术 应用抗原与抗体结合的免疫学原理，检测细胞内的多肽、蛋白质及膜抗原和受体等大分子物质的存在与分布。 其特点是特异性强、敏感性高、进展迅速，应用广泛。 程 序： 1抗原（提取动物某些肽类或蛋白质）注入另一动物体内 产生抗体（Ig）血清分离提取抗体 2抗体标记 抗体+荧光素（异硫氰酸荧光素）与相应抗原结合呈黄绿色荧光 抗体+辣根过氧化物酶（HRP）与相应抗原结合呈棕红色荧光,方 法： （1） 直接法 抗原抗体直接结合 简便、迅速， 但是敏感性较低。 （2）间接法 一抗体（作为抗原）注入物体内产生第二抗体 常用过氧化物酶抗过

8、氧化物酶复合物法（PAP法）。 较复杂，敏感性高 （3） 新进展 亲合素（卵白素）生物素法（LAB法） 桥连亲合素（卵白素）生物素法（BAB法） 亲合素生物素过氧化物酶复合物法（ABC法）(市场商品),组织培养术 : 体外研究活细胞或组织的有价值的手段 无菌条件下，取活组织、活细胞（或传代培养的细胞 株）培养液（天然或人工合成），在一定温度、 O2 、CO2、 、Ph培养（加某种受试因素）倒 置显微镜下观察：细胞活组织的增殖、分化、运动、 吞噬等。可连续录像观察。,正常培养细胞,中药组细胞,西药组细胞,对照组细胞,中药组细胞,原位杂交术: 即核酸分子杂交组织化学术。 基本原理：两条核苷酸单链片

9、段，在适宜的条件下，通过 氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA双链分 子的特点，应用带有标记的（有放射性同位素，如3H、35S、 32P、荧光素、生物素、地高辛等放射性物质）DNA或RNA 片段作为核酸探针，与组织切片或细胞内待测核酸（RNA或 DNA）片段进行杂交，然后可用放射自显影等方法予以显示。 在光镜或电镜下观察目的mRNA或DNA的存在与定位。用此 技术可在原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。 此方法有极高的敏感性和特异性，可进一步从分子水平探讨 细胞的功能表达及其调控机制，已成为当今细胞生物学、分 子生物学研究的重要手段。,放射自显影术: 是通过活细

10、胞对放射性物质的特异性摄入，以显示该细胞的 功能状态、或该物质在组织或细胞内的代谢过程。将放射性 同位素或放射性同位素标记的物质注入体内，间隔一定时间 后取材、制备切片，并在其上面涂以感光材料（感光乳胶或 贴以照相底片），置暗处暴光，再显影、定影。结果，在放 射性同位素或其标记物存在的部位，溴化银被还原为黑色的 微细颗粒，可在光镜或电镜下观察，从而获知被检物质在组 织或细胞内的分布及相对含量。在注入同位素标记物后，如 果有规律地在若干时间段取材，则可以观察到被检物质的动 态分布及变化过程，如将131I注入体内可以观察碘在甲状腺 滤泡内的代谢情况；将3H标记的胸腺嘧啶核苷注入体内，就 能研究蛋白

11、质或核酸在组织、细胞内的代谢过程。,组织工程 : 是用细胞培养术在体外模拟构建机体组织或器官的技术。 组织工程主要包括以下四方面： 获取生长旺盛的细胞,即种子细胞。准备细胞外基质， 包括生物材料(如牛胶原)及无毒、可被机体吸收的人工 合成高分子材料。构建组织或器官，即有目的地把种 子细胞置于细胞外基质中进行三维培养，并形成所需要 的形状。将构建物移植机体。目前正在研究构建的组 织器官主要有皮肤、软骨、骨、肌腱、骨骼肌、血管及 角膜等；其中以组织工程皮肤较为成功并已应用于临 床治疗烧伤、皮肤静脉性溃疡等疾病。,软骨组织工程研究进展,实验中的组织工程“耳” Cao YL，et al: Transp

12、lantation of chondrocytes utilizing a polymer-cell construct to produce tissue engineered cartilage in the shape of a human ear Plastic Reconstr Surg,1977,100:297,实验中的组织工程“耳”制备程序,1、将人的耳廓印下来，制成石膏软件。 2、生物材料（聚乙醇酸）形成耳廓模型。 3、取小牛关节软骨细胞，加入到耳廓模型 中，体外细胞培养 (1周）。 4、将耳模型植入到裸鼠背部。 5、4周后生长形成与人耳外形相同的“人耳”。,5形态计量术 形态

13、计量术 是研究组织和细胞内各种有形成分的数量、体积、表面积等项的绝对或相对值的方法。研究机体某些结构的立体数值的科学，称为体视学数值以“量”的概念进一步阐述了结构与功能关系及其病理状态下发生的变化。目前常用的精密定量方法有以下几种： （1）显微分光光度术 显微分光光度术是显微镜技术与分光光度技术的结合，可测出细胞内各种化学成分的含量，如测定蛋白质、酶、脂类、糖及DNA与RNA等含量。,（2）显微荧光光度术 显微荧光光度术是利用对细胞内原有发荧光的物质， 或对细胞内各种化学成分用不同荧光素标记后，进 行定性、定位和定量的测量。 （3）流式细胞术 流式细胞术是一种对流体单个细胞及其它生物微粒进 行快速定量分析与分选技术。同时可测量一个细胞8个 相关参数，测速可达5000个细胞/秒，分选纯度可高达 99%以上。,（4）图像分析术 图像分析术是把计算机、电视和数字图像 处理等结合在一起