放射生物学基础演示文稿---复件1

1、放射生物学基础,山东省医学科学院放射医学研究所 李洁清,第一部分 电离辐射的生物效应 第二部分 辐射生物剂量学,第一部分 电离辐射的生物效应,第一节 细胞的放射敏感性 第二节 电离辐射引起细胞死亡的类型 第三节 辐射诱导的细胞损伤及修复 第四节 电离辐射对生物体作用的机理 第五节 电离辐射对生物体物质代谢的影响 第六节 影响辐射生物效应的因素,细胞是复杂机体的功能单元，研究电离辐射对细胞的作用特点，是了解辐射整体效应的重要基础。但机体由各种性质与功能不同的细胞组成，它们对辐射反应有很大差别。,第一节 细胞的放射敏感性,放射敏感性：生物机体、组织、细胞或分子在严格控制为相同条件下受照，用同一种标

2、准来判定的生物效应发生的强弱程度及反应发生的速度大小。,不同细胞群体的放射敏感性,不断分裂更新的细胞群体：放射敏感性高 胃肠黏膜上皮细胞、生殖上皮细胞 一般定律：组织的放射敏感性与其细胞的分裂活动成正比，与其分化程度成反比。 淋巴细胞属于高度分化和不增殖的细胞，对辐射却非常敏感。 不分裂的细胞群体：放射敏感性低 神经细胞、肌肉细胞、成熟粒细胞、红细胞 基本不分裂的细胞群体：放射敏感性低，受刺激后迅速 分裂，放射敏感性增高。 再生肝,不同细胞周期的放射敏感性,细胞周期分为4个时相，即G1，S，G2和M相。部分细胞进入休止状态，称G0相。 细胞处于其周期的不同时相受照射的后果不完全一致，这是因为处

3、于不同时相细胞的放射敏感性不同。 M相细胞对辐射最敏感，较小剂量即可引起细胞死亡或染色体畸变，G2时相对辐射较敏感，G1时相次之，而S时相相对不敏感。 放射敏感性：MG2G1S 在多数细胞的周期中，对辐射最敏感的时相（M和G2相）所占比例是较短的。,G1 S G2 G1,M,相对存活 能力,环境因素对细胞放射敏感性的影响,细胞所处内、外环境影响其放射敏感性。环境中氧的存在将加强射线对细胞的杀伤力，这就是氧效应。 组织中的溶解氧增加自由基的稳定性和毒性。 细胞生长处于拥挤状态，其生长增殖受抑，放射敏感性降低。 照射后处于次佳生长环境下，染色体已受损伤的细胞不立即进入复杂的M相，有丝分裂的延迟有利

4、于DNA的修复。 细胞环境中存在有防护或增敏作用的化学因子，将降低或增高细胞放射敏感性。,第二节 电离辐射引起细胞死亡的类型,电离辐射引起细胞死亡，是辐射整体效应发生的重要基础。 淋巴造血细胞和小肠粘膜上皮细胞的死亡分别是造血型和胃肠型急性放射病的重要细胞学基础。 电离辐射诱发的不育症取决于生殖细胞的杀伤。 电离辐射诱发的脱发起源于毛囊上皮细胞的破坏。,增殖死亡,发生于分裂增殖的细胞，照射后细胞不立即死亡，仍进行与生命活动有关的代谢过程（DNA与蛋白质合成等），并可能发生细胞分裂，这种细胞死亡的标志是最终丧失继续增殖的能力，即生殖完整性的破坏。 使细胞丧失增殖能力的平均致死剂量一般在2Gy以内

5、，而立即破坏非增殖细胞的功能则需要达100Gy以上的剂量。 机制：辐射诱导染色体畸变，使子细胞不能获得一套完整的染色体，不能进入以后的正常分裂而死亡。,肿瘤由不断分裂增殖的细胞组成，肿瘤放射治疗的目的在于使肿瘤细胞丧失增殖能力而最终被消除，故临床放疗的分次方案一般每次给予2Gy照射。,间期死亡,照射剂量很大（100Gy以上）时，受照射细胞不论是否具有分裂增殖能力，将在有丝分裂的间期死亡。 胸腺细胞，淋巴细胞、A型精原细胞和卵细胞属于放射敏感性较高的细胞，1Gy以内的剂量足以引起50%以上的细胞发生间期死亡。,第三节 辐射诱导的细胞损伤及其修复,细胞放射损伤的分类,1致死性损伤（LD）：用任何办

6、法都不能使细胞修复的损伤。损伤不可修复，不可逆地导致细胞死亡。 2亚致死性损伤（SLD）：照射后经过一段充分时间能完全被细胞修复的损伤。正常情况下一般几个小时内修复。 3潜在致死性损伤（PLD）：受照射后环境条件影响的损伤，在一定条件下损伤可以修复。,细胞放射损伤的修复,1潜在致死性损伤的修复：受潜在致死性损伤的细胞，如改变其所处的环境条件，使细胞在特定剂量照射后的存活率增高。照后当细胞处于次佳生长条件，潜在致死性损伤即被修复，因为次佳生长条件使有丝分裂延迟，DNA损伤得以修复。机制：DNA双链断裂得到修复。 2亚致死性损伤的修复：照射后损伤经过一段充分时间能完全被细胞修复。机制：DNA单链断

7、裂，经过一定时间，基因组中受损伤部位被酶切除，以DNA另一条单链为模板复制修复。 3缓慢修复：用刺激细胞增殖方法观察到受照后毛细血管内皮细胞缓慢修复的过程，其半修复时间为一周，与潜在致死性损伤修复类似，但时间很长。,影响细胞放射损伤及修复的因素,1、放射种类： 低LET：损伤相对小，存在亚致死性损伤的修复、 射线LET 潜在致死性损伤的修复。 高LET：损伤相对大，基本不存在修复。,2、剂量率：总剂量一定，剂量率越低，照射时间越长，生物效应越轻。,高剂量率急性照射,低剂量率迁延照射,Time,急性 剂量,分割剂量,Time,3、氧效应：氧是最好的辐射敏化剂，环境中氧的存在加强辐射对细胞的损伤。

8、 4、辐射增敏剂：卤代和 DNA 基底取代物（ 5-溴基-溴和 6-硫-鸟嘌呤）， 电子亲和性符合物（硝基咪唑、醚醇硝唑和硝基呋喃) 5、辐射防护剂：巯基化合物(巯基丙氨酸, 乌洛托品和硫脲)。 6、增温：与X射线合用能增加辐射效应。,第四节 电离辐射对生物体作用的机理,电离辐射作用于机体，最早期是物理和生物化学的变化 能量的吸收组织分子的电离和激发引起生物大分子的变化机体的损伤、死亡,电离和激发,细胞内的分子种类很多，其结构功能的复杂程度不一，从辐射效应方面看生物大分子和水分子具有特别重要的意义。 当放射能量被吸收而引起机体内一系列的复杂变化时，将导致一些化学键的断裂。 由于生物体内含大量水

9、，水分子电离产生一个正离子和一个自由电子，随之发生一系列复杂反应形成许多化学产物。 辐射可以作用于细胞内生物大分子引起损伤，而细胞内的大分子又是存在于大量水分子的环境中。辐射也可以作用于水分子，引起水分子的改变产生许多活性产物，后者又可引起生物大分子的损伤。,直接作用,电离辐射的能量直接沉积于生物大分子，引起生物大分子的电离和激发，破坏机体的核酸、蛋白质、酶等具有生命功能的物质，这种直接由射线造成的生物大分子损伤效应称为直接作用。 生物体内的这些变化并不能单纯以直接作用来解释，因为含水分多的物质受到同样剂量的辐射损伤较严重。,间接作用,在生物机体中主要是指辐射通过水的原发辐射产物(H+ 、OH

10、-、H2、H2 02)对生物大分子的作用，引起后者的损伤。由于体内细胞的含水量很高，因此间接作用具有重要意义。,(1)稀释效应:如果辐射作用是间接的，则一定剂量的电离辐射在溶液中产生固定数量的自由基，它只能使固定数量的溶质分子失活，与溶液的浓度无关，失活分子的百分数随溶液浓度增加而下降。也就是最大的相对效应发生在最稀释的溶液中。 实验证明，不同浓度酶溶液受一定剂量的辐射作用，当浓度相差60倍时，失活的酶分子数仍然相同，所以在稀释溶液系统中间接作用占主要地位。,(2)氧效应: 受照的组织、细胞或血液系统，其辐射效应随周围介质中氧浓度的增加而增加。主要由于氧与水的电离产物-自由基相互作用，形成更加

11、活泼的产物，加强了辐射的损伤效应。,(3)防护效应: 在受照射体溶液系中，加入其他物质，能够减轻辐射对溶质的损伤效应，称防护效应，其他物质对该溶质的损伤起到了保护作用，这些物质也称为自由基清除剂。 例如向酶的稀溶液中加入其他物质，如蛋白质等，可使辐射引起的酶分子的失活率降低。,(4)温度效应: 溶液系统或生物机体受照射时，降低温度或其使处于冰冻状态可使辐射损伤减轻，即称为温度效应或冰冻效应。 可能由于自由基扩散受阻。,第五节 电离辐射对机体物质代谢的影响,电离辐射作用于机体时，可引起机体一系列复杂的变化包括生物大分子和细胞微细结构的损伤与破坏、代谢紊乱、功能障碍等。物质代谢是机体发生机能形态变

12、化的物质基础。 放射病时，各种病变与物质代谢障碍有密切关系，因而研究代谢的改变可以对放射病的诊断、预后及治疗措施提供客观依据。,电离辐射对能量代谢的影响,能量代谢是保障机体生命活动的极为重要的生物化学过程，三磷酸腺苷(ATP)的形成率是物质代谢中关键问题，同时也是射线影响能量代谢的重要环节，生成ATP最重要的生物化学过程是氧化磷酸化作用，其效率以P/O比值表示，即每消耗一原子氧所形成的高能磷酸键的数目。 线粒体是细胞内进行氧化磷酸化的主要场所。射线对线粒体氧化磷酸化的抑制是辐射敏感组织的早期效应之一，其特点是效应出现时间早，反应灵敏，抑制程度在一定剂量范围内与照射剂量有依存关系。 核氧化磷酸的

13、严重抑制见于间期死亡这一类型的细胞，其特点是损伤效应明显，变化出现早。,电离辐射对核蛋白与核酸代谢的影响,核酸与核蛋白是构成各种细胞结构的重要成分，是遗传的物质基础。实验结果表明，骨髓、胸腺、脾脏、淋巴结、小肠等组织细胞中的核蛋白具有高度辐射敏感性。 电离辐射后，DNA分子本身可因吸收射线能量形成自由基而受损伤，亦可因DNA分子周围的水分子水解产物的作用而引起损伤。DNA分子辐射损伤的形式主要有碱基损伤、糖基破坏、氢键断裂、DNA链断裂，DNA-DNA交联和DNA-蛋白质交联。,电离辐射对蛋白质代谢的影响,蛋白质是体内的核蛋白酶、激素等生命活性物质的基础，射线使蛋白质分子结构破坏的同时，也使其

14、代谢发生紊乱，主要表现为分解代谢增强以及合成代谢的抑制。 机体受到大剂量电离辐射作用后，机体组织细胞内蛋白质的分解加剧，组织细胞内游离氨基酸的含量及尿中氨基酸、牛磺酸、肌酸和尿素的含量增加。 从各种不同种类和功能的蛋白质来看，抗体、核蛋白、肌纤蛋白等有重要生物学功能的蛋白质的生物合成可被射线抑制。急性照射后血清蛋白总量变化较小，但血清蛋白的组成可发生明显的变化，主要是白蛋白减少、球蛋白增多，白蛋白与球蛋白的比值降低，慢性放射病时出现白蛋白轻度减少和球蛋白增高。,电离辐射对糖代谢的影响,急性放射病初期，常见肝糖原量增多，血糖增多，即使是饥饿的动物受照也是如此。这是由于组织蛋白质大量分解，供给生糖

15、氨基酸，生成大量葡萄糖，以及肌糖原分解形成肝糖原，亦即糖原异生作用加强，皮质类固醇分泌增多也是有关的因素。 放射病晚期，肝糖原含量降低，组织中糖原量降低，这可能由于合成肝糖原的机能被破坏，食量减少，吸收减少等因素所造成。,电离辐射对脂类代谢的影响,放射病早期，可能因为胃肠道机能障碍，吸收脂肪减少以及脂肪组织的分解代谢增强，致使机体内总脂量减少。 放射病晚期人或动物显著消瘦，因为肝糖原和组织糖原减少，储存的脂肪被利用来作为内源性营养材料。此时，脂肪过多地通过血循环到达肝脏改造和利用，引起血中脂类物质增多，出现脂血症，也引起肝脏脂肪增多，发生肝脏脂肪浸润。脂肪在肝内的氧化大大加强，使乙酰辅酶A含量

16、增多，大量转变为酮体，血中酮体增高，引起酸中毒。多余的酮体经肾排出，出现酮尿症。骨髓中脂类合成代谢加强，脂肪大量堆积，影响骨髓的造血功能。,电离辐射对水、电解质代谢及酸碱平衡的影响,急性放射病时，由于水向细胞外间隙和胃肠道移动，导致血容量减少。如发生腹泻及呕吐则引起急性脱水，电解质随之丧失。早期血清钾增高，是由于放射敏感组织细胞膜通透性改变及细胞解体的结果，晚期钾流失，出现顽固性低血钾，钠及氯也明显减少，常出现代谢性酸中毒。,电离辐射对膜的效应,DNA和膜都是射线损伤的靶，膜是由蛋白质(包括酶)和脂类(主要是磷脂)组成，还含少量糖蛋白和核酸。射线可使肽键和氢键断裂，引起膜功能丧失。 膜脂质分子

17、中的多不饱和脂肪酸对射线很敏感，易被自由基所氧化，形成脂质过氧化，使膜中的蛋白质和酶分子发生聚合和交联，导致线粒体破坏，DNA合成和细胞分裂受抑，染色体畸变。 DNA-膜复合物对辐射特别敏感，被认为是细胞内辐射靶。正常DNA的复制开始于细胞核中的一个特定的起始点，叫做复制子，它通过间体连接于核膜上，射线破坏了DNA与核膜的连接，致使DNA复制停止，并降解引起细胞死亡。,第六节 影响电离辐射生物效应的主要因素,与辐射有关的因素,1、辐射种类：电离密度和穿透能力是影响其生物学作用的重要因素。 射线：电离密度大，穿透能力弱，外照射损伤小，内照射损伤大。 射线：电离密度小，穿透能力大，外照射致皮肤表层

18、损伤，内照射致明显生物效应。 射线、高能X线：穿透力强，电离密度小于、射线，外照射时引起严重损伤。,2、辐射剂量：剂量愈大，效应愈显著，急性全身照射时照射剂量与平均生存时间的关系曲线是“S”型曲线。 剂量低于1Gy，效应不明显； 1-10Gy之间，剂量愈大，平均生存时间愈短，剂量与效应基本上呈线性关系； 10-100Gy之间，平均生存时间处于一个坪值； 剂量超过100Gy时，平均生存时间又随剂量加大而缩短。,3、辐射剂量率：单位时间内机体所接 受的照射剂量 一般情况下剂量率越高，生物效应越显著，但当剂量率达到一定范围时，生物效应与剂量率之间失去比例关系。 急性放射损伤有一定的剂量率阈值，剂量率

19、0.05-0.1Gy/min时，有可能引起急性放射病。,4、分次照射：同一剂量的辐射，在分次给予的情况下，其生物效应低于一次给予的效应，分次愈多，各次间隔时间愈长，生物效应愈小。这与机体的修复过程有关。 5、照射部位：当照射剂量和剂量率相同时，腹部照射的全身后果最严重，依次为盆腔、头颈、胸、四肢。,6、照射面积：当照射的其它条件相同时，受照射的面积愈大，生物效应愈显著。 临床放疗中，原则上照射野缩至尽可能小的范围并分次照射。 7、照射方式：内、外、混合照射。 外照射：分为单向或多向照射，其它条件相同时，多向照射的生物效应大于单向照射。 内照射：影响因素有放射性核素的物理化学特性、摄入途径、分布

20、、排出、物理半衰期、生物半排期等。,与机体有关的因素,1、种系的放射敏感性：总趋势是随着种系演化越高，机体组织结构越复杂，放射敏感性越高。 2、个体发育的放射敏感性：哺乳动物的一般规律是放射敏感性随着个体发育过程而逐渐降低。 植入前期的胚胎（人妊娠0-9d）对射线最敏感，0.05-0.15Gy即可杀死受精卵。 器官形成期（人妊娠35d左右）受到照射，主要出现先天性畸形，以中枢神经系统畸形为常见，胚胎死亡率较前一阶段降低。 胎儿期放射敏感性较低，引起器官结构和功能变化需要较大剂量。,3、不同器官、组织和细胞的放射敏感性：一种组织的放射敏感性与其细胞的分裂活动成正比而与其分化程度成反比。 人体各种

21、组织的放射敏感性： 高度敏感的组织：淋巴组织，胸腺，骨髓，胃肠上皮，性腺，胚胎组织 中度敏感的组织：感觉器官（角膜，晶状体），内皮细胞（血管、血窦、淋巴管内皮细胞），皮肤上皮，唾液腺 低度敏感组织：中枢神经系统，内分泌腺，心脏 不敏感组织：肌肉，软骨和骨，结缔组织 例外情况：卵母细胞和淋巴细胞，不迅速分裂，但两者都对辐射敏感,4、亚细胞和分子水平的放射敏感性 同一细胞的不同亚细胞结构的放射敏感性差别很大，细胞核放射敏感性显著高于细胞浆。 细胞内不同分子相对放射敏感性：DNAmRNArRNA和tRNA蛋白质。,第二章 辐射生物剂量学,第一节 生物剂量测室 第二节 辐射诱导的染色体畸变 第三节 辐

22、射诱导染色体畸变的剂量效应关系 第四节 其他电离辐射生物剂量计,第一节 生物剂量测定,辐射防护工作中，准确及时地估计受照者吸收剂量至关重要。 用物理仪器现场模拟，推算受照剂量 通过生物学指标检测估算受照剂量,生物剂量计,生物剂量测定：用生物学方法对受照个体的吸收剂量进行测定。 生物剂量计： 人体生物材料如组织、细胞、DNA、蛋白质等，在电离辐射后发生的与辐射剂量存在一定量-效关系的某个方面的改变，利用这种可测、可记录和分析的生物改变来刻度辐射剂量的一类生物标记物与分析方法。 条件：短期得出结果 一定的特异性和敏感性 效应和剂量之间有良好的量-效关系 整体和离体照射量效关系统计学上没有显著性差异

23、 有一定的剂量范围,第二节 辐射诱导的染色体畸变,染色体畸变分析在辐射损伤中的应用起始于上世纪60年代初期。在过去的几十年里，国内外学者利用人体外周血细胞体外培养这样一个理想的体系，对各种射线(x, 射线和中子等)不同的照射条件引起的染色体畸变所作的大量实验研究证实，染色体畸变是反应电离辐射损伤的良好指标之一，不仅能检测电离辐射损伤和评价其损伤程度，而且能用照射离体人血所建立的染色体畸变剂量效应曲线估算事故受照的剂量。,人类染色体及形态特征,染色体(chromosome)是指细胞核内可被碱性染料染成很深颜色的小体，由DNA和蛋白质组成。它是基因的载体，是研究生物遗传物质的基础。,染色体数目,人

24、类46条染色体，其中44条为男性和女性所共有的，与性别无关，称为常染色体。另一对则与性别有关，称为性染色体，在男性为X Y，女性为XX。 每一对中的一个染色体来自父亲，另一个来自母亲，这一对染色体在减数分裂过程中彼此配成对,这样的染色体称为同源染色体。 成熟的生殖细胞中，精细胞和卵细胞，由于减数分裂，染色体数目减少一半，只含有一个染色体组，称单倍体，用n表示。在体细胞中染色体成对存在，称为二倍体(Diploid)，用2n表示。,染色体的形态结构,染色体的形态结构在细胞分裂中期最为典型，因此对于染色体的计数和形态观察都是在细胞分裂的中期进行。 每条染色体都有两个臂，两臂之间以着丝粒相连。正常染色

25、体只有一个着丝粒。按着丝粒的位置不同，可分中着丝粒，亚中着丝粒，端着丝粒染色体。除臂和着丝粒外，有的染色体的末端还有一球形的随体，以细丝相连。臂的长短和着丝粒的位置，有无随体等，可作为鉴别染色体的指标。,显微镜下染色体图像（10 x100）,染色体的组型,用图像核型自动分析装置或显微扫描的方法把中期分裂细胞的染色体，按着它们的形态标志和标准的顺序进行排列。 按照染色体的长度和着丝点的位置以及其它标准，将44个常染色体配对编号为1-22，及性染色体。 A组(1-3)：为最大的3对染色体，它们的着丝点在中部或接近中部。 B组(4-5)：有明显的长短臂之分。 C组(6-12)和X染色体：为中等大小的

26、亚中着丝点染色体，按染色体的大小顺序排列，因为X染色体在常规染色片上形态上难以与这一组的染色体相区分，故此组包括X染色体在内。 D组(13-15)：为中等大小的端着丝点染色体，在它们的短臂上有时可见到随体。 E组(16-18)：这是具有近中着丝粒的比较短的染色体。 F组(19-20)：为小的中着丝粒染色体。 G组（21-22)和Y染色体：为小的端着丝粒染色体，在它们的短臂上可以见到有随体。,各组染色体的形态特征,染色体核型（女性）,辐射对染色体的影响,人类外周血淋巴细胞染色体对辐射具有高度的敏感性，不同种类的电离辐射均可诱发淋巴细胞染色体畸变，而且在一定条件下染色体畸变与辐射剂量间存在明显的剂

27、量-效应关系。 对慢性小剂量职业受照者进行定期医学检查时，染色体结构改变可早于临床或化验指标的变化，因此可利用人体细胞染色体畸变分析来检测早期的辐射损伤，作为生物剂量计来估算辐射剂量。,染色体畸变类型,当人员受到一定剂量电离辐射作用后，在外周血淋巴细胞和骨髓细胞中早期即可见到染色体的改变，电离辐射诱发的染色体畸变主要表现为数目的变化以及染色体结构的改变。 染色体型畸变：染色体两个单体上相同位点 染色体结构畸变 染色单体型畸变：一个染色单体上的一定位点 染色体数量畸变,染色体畸变与细胞周期的关系,染色体在细胞分裂的中期形态特征最为典型，所以观察染色体结构改变，首先要使细胞进行分裂，并使之中止在有

28、丝分裂的中期进行观察，在人类绝大多数是采用外周血淋巴细胞。正常情况下人体外周血淋巴细胞是不分裂的，在有丝分裂剂存在情况下，经过短期培养，就可以得到大量中期分裂相细胞。 由于人外血淋巴细胞不进行分裂，几乎都处于细胞周期的G1期或G0期，有丝分裂时间很短，只有1-2小时。受照射的细胞中产生的染色体畸变虽然要到有丝分裂中期才能看到，但实际上几乎所有的畸变都是在间期受到损伤的结果。,如果细胞在G1期或G0期受照，由于DNA尚未合成，染色体是以单根线行使其功能，由此造成的损伤经S期复制成二份，所以染色体的两个染色单体改变相同，为染色体型畸变。 如果细胞在G2期或S期后期受照，那时的染色体已经过S期复制成

29、两个染色单体，所涉及的损伤一般只是两个染色单体中的一个，即使两个染色单体都受到损伤，但损伤部位也未必相同，所以在中期观察时两个染色单体的改变不相同，形成染色单体型畸变。,染色体型畸变,1.末端缺失（del）一条染色体长臂或短臂的远端发生一次断裂后，断片离开原位，一染色体丢失了末端区段。 实际工作中观察到的是断下来的片段部分，称为无着丝粒断片（ace），一对平行的染色体。 2.微小体(min) 染色体臂内发生两个断裂，形成三个片段，两个断裂之间的片段离开原位，余留的两个断端在断面直接相接。片段比无着丝粒片段小，典型的为一对圆形的染色质球。 3.无着丝粒环（ r。）与微小体实际上是一种畸变类型，r

30、。断裂点之间距离较大，形成一对环形的染色体，没有着丝粒。,4.着丝粒环（rc）染色体长短臂各发生一次断裂，含有着丝粒片段的两端断面相互重新连接成环状结构，两个无着丝粒片段连接成一个断片，计数染色体畸变时，着丝粒环加上断片计数为一个染色体畸变。 5.倒位（inv） 一条染色体发生两次断裂，形成上，中，下三个片段，中段上下颠倒，然后和上下两段相接，形成倒位。如果两处断裂发生在着丝粒两侧，称为臂间倒位；两处断裂发生在着丝粒一侧，称为臂内倒位。 6.相互易位（t） 两条染色体各发生一处断裂，并相互交换其无着丝粒片段，形成两个重排染色体。 7.双着丝粒体和多着丝粒体（dic）：两条或以上染色体各发生一处

31、断裂后，具有着丝粒部分连接成双着丝粒体或多着丝粒体，无着丝粒片段相接形成断片。,dic+ace,rc+ace,末端缺失为一次击中畸变，其余均为射线的二次击中畸变。 目前在非显带染色体标本中，最常用的指标为双加环，双着丝粒体畸变是电离辐射损伤和估算剂量的最佳指标。,稳定性畸变：倒位和相互易位。引起染色体片段的位置改变，但仍保留基因总数，通常不引起明显的遗传效应，在子细胞中能保持相对恒定而继续保留下来。 不稳定畸变：末端缺失、双着丝粒体、着丝粒环、无着丝粒环和微小体。引起遗传物质在分裂过程分配不均匀，造成子细胞遗传物质不平衡，导致细胞死亡。着丝粒环由于几何学上的原因，在细胞分裂时被丢失。,染色单体

32、型畸变,在G2期或S期大部受照，由于染色体已复制为两条单体，辐射诱发的畸变呈单体型畸变。 1.染色单体断裂（ctb）：一个染色单体被打断，远端部分离开原来位置，导致染色单体缺失和染色单体断片。 2.染色单体互换（cte）：两个或两个以上染色单体断裂和断裂后染色单体重排。 3.裂隙（gap）：染色单体出现轻微的错排，光学显微镜下观察到很小的裂缝，宽度不超过染色单体的横径。,染色体数量畸变,正常人体细胞含有23对同源染色体，是二倍体，受到照射后染色体数量会发生畸变 。 1.多倍体：具有两个以上染色体组 2.非整倍体：某对同源染色体减少或增加一条或多条，其他染色体对仍保留二倍体不变。亚二倍体，超二倍

33、体 3.核内复制：两次细胞分裂之间染色体不是复制一次而是两次，得到的不是两条姐妹染色单体而是四条。 机制：染色体不分离,畸变结果表示法,畸变率（畸变数/细胞）= 畸变数/分析细胞数x 100% 注意！应具体说明是什么的畸变率 双着丝粒加着丝粒环畸变率（简称双+环，d+r）； 无着丝粒畸变率（断片、微小体、无着丝粒环）； 总畸变率（ d+r+无着丝粒畸变率）。 畸变细胞率（%）= 畸变细胞数/分析细胞数x 100%,第三节 辐射诱导染色体畸变的 剂量-效应关系,剂量-效应曲线的模式,世界卫生组织（WHO）推荐下列4种数学模式进行拟合： 1.直线方程：Y=a+bD 2.平方方程：Y=a+cD2 3

34、.直线平方方程：Y=a+bD+cD2 4.指数方程：Y=a+kDn,拟合模式的选择,低LET辐射：辐射诱导淋巴细胞二次击中畸 变剂量-效应曲线的模式 Y=a+kDn 诱导的双着丝粒体与受照剂量关系 Y=a+bD+cD2 高LET辐射：辐射诱导淋巴细胞二次击中畸变 剂量-效应曲线的模式 Y=a+bD+cD2,建立剂量-效应曲线的原则,1.尽量仿照活体照射情况 2.选用不吸烟的正常健康个体，非放射性工作者，半年内无射线和化学毒物接触史，近一个月内无病毒感染。 3.0.1-5Gy剂量范围内，选择8-10个照射剂量点。 4.取上述人员血样，（370.5）进行均匀立体照射，血液照射后在37条件下放置2小

35、时再进行培养。 5.畸变分析采取盲法阅片：只分析受照后第一次分裂的中期细胞；选择分散良好，含有461个染色体的中期细胞；应征得两个分析者的确认。,测定估算生物剂量,测定步骤：具备标准的剂量效应曲线 制备受检人员染色体标本，分析畸变率 根据刻度曲线或回归方程式推算出受照剂量 注意： 1、给出平均值同时应给出95%可信限剂量范围。 2、估算剂量的可信程度取决于观察到的畸变量和分析细胞数，大剂量急性照射，分析100-200个细胞可满足统计学要求；一般情况计数200-500个中期分裂细胞可满足有医学意义的剂量估算，在较小剂量照射时，每份标本要分析500个以上细胞。 3、取样时间：原则上应尽早取血培养，

36、最迟不超过2个月。因为生物剂量测定采用分析非稳定性染色体畸变（双十环），此类畸变随照后时间的推移而逐渐减少。,染色体畸变分析在剂量估算中的应用,在以往的多次辐射事故中，多数人均未佩戴个人剂量计，在这种情况下，剂量估计的物理方法是通过回忆事故过程的调查，模拟操作和现场剂量测量等手段，取得剂量估算所需要的重要资料。通常情况下，用物理方法在照后24小时内可以给出初步估计。 生物学方法是通过测定受照者本身的一些生物样品的变化估算剂量的，因此在物理方法无法提供剂量情况下，有时需要有生物学方法给以辅助。 对于较复杂情况的事故，如1987年巴西Goiania 137CS事故，并有137CS体内污染，用物理方

37、法无助于剂量估计，医生获得基本信息是来自生物学数据。,染色体畸变分析在慢性辐射损伤中的应用,双着丝粒染色体大于或等于1%，稳定性畸变大于或等于1%，断片3%等三项指标，如果其中二项成立者，具有临床诊断价值。 染色体型畸变率大于2%或双着丝粒或着丝粒环一个，有接触史，有临床症状，有或无其他检查阳性结果前提下，可拟诊断放射损伤。 我们实验室建议：染色体畸变率2 %，或染色体畸变 1 %+微核细胞率4时，结合临床资料，可拟诊放射损伤。 目前看来，染色体畸变作为综合诊断指标之一，对判断慢性放射损伤有辅助诊断价值。,染色体畸变分析作为生物剂量计的优点,1.估算剂量范围广，可估算的范围约为0.20 20G

38、y，但一般在0.25 5Gy之间较为可靠。 2.局部或全身照射时，染色体畸变数随剂量增加而增加。 3.染色体畸变出现早，持续时间久，不论在照后立即或数天后采血培养都可用来作生物剂量测定，也可用作远期效应的观察指标。 4.人体外周血淋巴细胞离体照射诱发的染色体畸变率基本上和相同剂量的整体照射后的变化接近，便于制作刻度曲线进行生物剂量测定。 5.取材方便，可重复取样，用血量少，对人体不会造成痛苦和危害，易被接受。 6.根据畸变率推算的剂量与物理方法推测的剂量大体一致。 7.不需要有特殊或昂贵的设备，一般细胞培养实验室内即可开展工作。 通过多年的事故实际应用，染色体畸变分析估计剂量的最低值射线为0.

39、1Gy, X线为0.05Gy，裂变中子为0.01Gy。,淋巴细胞培养液主要成份,RPMI 1640培养基：细胞生长的必要营养 血清：提供生长素，约占培养液的20% 植物凝血素（PHA）：刺激淋巴细胞母细胞化，进行有丝分裂，终浓度约100g/ml。 抗菌素：抑制细菌生长，终浓度100 IU/ml。 秋水仙素：使细胞分裂停止在中期，染色体缩短变粗，终浓度0.04 g/ml。,淋巴细胞培养,细胞接种：无菌肝素抗凝血 摇匀 培养瓶盖紧密闭 培养温度与时间：37.50.5 0C 48-72h 加秋水仙素： 辐射损伤：培养开始或终止培养前6h （终浓度0.04g/ml）,制片步骤,1.低渗：8ml 0.0

40、75mol/L KCl,10min （注意！立即充分吹散团块20-30次）。 2.预固定：甲醇：冰乙酸（3：1v/v）0.5-1ml （注意！吹气泡式轻轻吹匀）。 3.固定：6ml ，20min，重复一次（可长期保存）。 4.滴片、空气干燥：有多种操作手法 （注意！形成固定的操作手法）。 5.染色：8%吉姆萨染液，染色10min （注意！要新配，可用固定液脱色后复染）。,第四节 其他生物剂量测定方法,微核分析,微核（Micronucleus）在诱变剂作用下，断裂残留的无着丝粒断片（染色体碎片)或在分裂后期落后的整条染色体，在分裂末期都不可能纳入主核。当进入下一次细胞周期的间期时，它们在细胞质内

41、浓缩成小的核，一般小于主核的1/3,着色与主核相同或略浅。 微核测定是1971年由Matter和Schmidt建立的一种新的细胞遗传学测定体系， 1973年 Heddle推荐使用这种简便而迅速的方法来衡量染色体损伤。 1976年Countryman和Heddle用不同剂量X线照射离体人血，经培养后观察微核率，结果微核率与受照剂量呈良好的相关性，表明淋巴细胞微核率可以作为估算受照剂量的生物学指标，并开始用于事故的生物剂量估算。 目前，该方法已被一些国家和国际组织推荐为检测致癌剂、诱变剂常用的一种遗传毒理学方法。,微核的形态学特征,1.微核直径为主核直径的1/16-1/3 2.微核不折光，可与染料

42、的颗粒等人工产物相区别 3.微核与主核不相连 4.微核与主核不重叠，如果相接，必须能鉴别出各自的边缘 5.染色深浅与主核相同，偶尔比主核略深或略浅,转化淋巴细胞的识别,微核的表示法,微核率（） =微核数/观察细胞数1000 微核细胞率（） =含微核的细胞数/观察细胞数1000 微核检出率（%） =微核阳性例数/观察例数100,微核测定法 直接法 常规培养法 胞浆分裂阻滞法:CB微核法,不同方法微核自发率,直接法： 均值 0.1-0.3 ，正常范围0-1.0 常规培养法： 均值1.2，正常范围0-3.0 CB法： 均值10-20，正常范围0-30,微核形成与染色体畸变的关系,有关系 染色单体断裂

43、可形成微核 无着丝粒畸变、伴随性断片可形成微核 不等同 有些染色体结构畸变不形成微核（易位、倒位、插入缺失等） 单条或多条染色体滞后形成微核，又不是结构畸变,微核估算剂量时的注意事项,受照后应尽早取血，微核不能超过30天。 培养条件、制片方法和分析标准应与建立刻度曲线时相同。对被估算剂量的个体应分析足够的细胞数。 应选择和事故条件接近的刻度曲线进行剂量估算，在曲线的剂量范围内应用，一般不外推。 估算剂量时，除给出平均值，同时应给出95%可信限范围。,微核测定在辐射损伤中的应用价值,1.急性辐射的早期诊断 人外周血淋巴细胞对电离辐射敏感，淋巴细胞微核测定方法简单成熟。将淋巴细胞微核检测作为一种生

44、物学剂量计，获得较好的剂量-效应相关性。在核事故情况下，尽早提出受照者的剂量对指导临床救治，预测病情发展有重要意义。 2.作为辐射损伤评价和诊断指标 辐射引起的染色体损伤，作为生物剂量计是公认的，在职业照射和事故照射的剂量估算方面起着重要作用。同样微核发生率和辐射剂量有很好的相关性，受照机体细胞中微核率的高低，可以反映损伤效应的严重程度。微核测定和染色体一样可作为生物剂量计，许多研究工作也已证明了这一点。可用直线回归方程式：Y=a+bD来推导。,3. 作为人群辐射敏感性的检测指标及射线工作者健康检查指标 用染色体畸变分析对较大人群作出辐射敏感性的评价，需要大量人力和时间。而微核检测方法简单，分

45、析快速，容易掌握，又有利于自动化，尤其在事故涉及的人员较多时或较大人群普查时更显示其优越性。,与染色体双着丝粒分析相比，微核分析方法的优点是操作简单，分析迅速，适合大规模人群监测；缺点是不像双着丝粒体对电离辐射那样敏感、特异，自发率较高，个体差异较大，自发率与性别无关，但与年龄呈正相关系，所以估算剂量的下限值的不确定度较高，微核的衰减速度比双着丝粒体快。,CB法微核分析,微核仅出现在诱发后经过一次分裂的间期细胞中，过去由于常规培养法微核检测不能分辨出未转化的、分裂一次的和分裂一次以上的淋巴细胞，影响了微核分析的正确性。 1985年Fenech等提出胞浆分裂阻滞微核法(CB法)，该法采用在培养基

46、中加入松胞素-B( Cyt-B) ,后者在不干扰细胞核分裂的同时阻滞胞浆的分裂。于是，分裂一次的所有淋巴细胞的胞浆中将出现两个细胞核，这种双核细胞称为cytokinesisblock cell，简称CB细胞。,CB细胞很大，具有双核，极易鉴别。如果第二次胞浆分裂被阻滞，则形成3核或4核细胞，故双核CB细胞是只经历一次分裂的细胞。计数CB细胞中的微核率，可显著提高微核检测的灵敏度和准确性。,双核的标准,位于一个细胞质内、互相不连接的两个独立的核，如果有一个或多个核质桥连接，桥不宽于主核的1/4 两个核的大小接近，色度深浅相同 两个核不重叠，如果重叠必须能识别各自的界限 一个双核细胞胞质与邻近细胞

47、的胞质界 限清楚,CB微核的影响因素,1. Cyt-B浓度对双核CB细胞产额的影响； 2. Cyt-B浓度对微核率的影响； 3. 加入Cyt-B的时间和培养终止时间； 4. 照后时间对微核率的影响； 5. 其他影响因素。,CB微核的应用,辐射诱导的微核率和微核细胞率随剂量增高而增加，其剂量-效应关系可拟合直线模式，即Y=a+bD，或二次多项式，即Y=a十bD十cD2。 放疗病人和动物实验对淋巴细胞整体和离体照射的研究表明，CB微核剂量-效应曲线在统计学上无显著性差异。 近年来，在事故受照人员的生物剂量测定中，已有多例实际应用的报道，并与染色体畸变分析估算的剂量进行比较，结果两种方法估算的剂量基

48、本一致。 目前认为CB法微核估算剂量范围在0. 25-5. 0Gy之间较为准确。,荧光原位杂交 Fluorescence in situ Hybridization (FISH),FISH技术是近年发展的一种快速、敏感、特异分析染色体结构畸变的方法 ,并已尝试作为电离辐射生物剂量计应用于事故照射的剂量估算和早先受照者的剂量重建 。 Pinkel等(1986年)首先将FISH技术引入辐射研究领域，开创了辐射生物剂量测定的新篇章。 FISH是检测已固定在玻片上特有核酸序列的一种高度敏感、特异的方法。其基本原理是利用生物素(biotin)标记的已知碱基序列的核酸作为探针，按照碱基互补的原则，与标本上

49、细胞染色体的同源序列核酸进行特异性结合，然后用荧光标记的生物素亲和蛋白(a-vidin)和抗亲和蛋白的抗体进行免疫检测和放大，使探针杂交区发出荧光，形成可检测的杂交双链核酸，最后在荧光显微镜下检查探针存在与否。结合了探针的染色体呈现出特定的颜色，未结合探针的染色体就不着色，因而着色与未着色的染色体间发生了互换，这种异常的染色体在荧光显微镜下非常容易鉴别。,单色FISH-1号着丝粒探针,多色荧光原位杂交,FISH在生物剂量测定中的应用,辐射诱发的双着丝粒体和易位与照射剂量间呈良好的量效关系。 急性照射的剂量估算主要分析双着丝粒体。双着丝粒体的检测，在FISH技术可以用泛着丝粒探针进行杂交，杂交后

50、使细胞中的染色体着丝粒区着色，在荧光显微镜下能快速计数双着丝粒体。 易位在受照者体内能长期保持相当恒定，特别适用于慢性照射和早先受照者的剂量估算。以往对易位的检测，主要用显带方法，该技术要求高，且显带法分析易位复杂而费时，无法分析大量的细胞。FISH弥补了传统染色体畸变分析和G显带分析的不足，它通过特异性DNA探针，使特定的染色体着色，从而能迅速有效地检测与这些染色体相联系的染色体结构畸变，使易位染色体的分析大大简化。,目前，FISH技术已在生物剂量测定中进行了广泛的研究。离体照射研究中，一般采用全染色体探针和全着丝粒探针检测离体易位和双着丝粒体的量效关系，结果一致表明易位和双着丝粒体的剂量-

51、效应关系均符合线性平方模式，即Y=a+bD+ cD2。在事故照射研究中， Straume等报道对巴西Goiania的137Cs事故中的5人分别用1,3和4号与1,2和4号两组组合探针对其易位率进行测定，并估算剂量，结果与事故后立即用双着丝粒体所估算的剂量接近。,优势：能够检出低剂量率低水平辐射诱导的染色体损伤，可以大大提高易位的检出率，与G显带技术相比，节省了人力物力，由于不需要分散良好的中期分裂相作分析用，增加了可供分析的细胞数，提高了检测的精确度，是一种快速的、准确的很有前途的生物剂量测定方法。 缺点：对某些稳定性染色体畸变，如倒位和缺失等不甚敏感;由于探针的特异性，只有某些与探针相对应的染色体畸变才能被察觉;该技术要求