1.2基因工程的基本操作程序04677.ppt

1、1.2 基因工程的基本操作程序,补：原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。,转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。,转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。,补：真核细胞的基因结构,编码区,与RNA聚合酶 结合位点,内含子,外显子,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能够编码蛋白质的序列叫做内含子,启动子,终止子,内含子：,外显子：,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列 内含子：不能编

2、码蛋白质的序列,：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的RNA 聚合酶结合位点。,非编码序列：,包括非编码区和内含子,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？,连续,不连续,编码区,非编码,原核细胞不具有剪切、拼接mRNA的能力，所以真核细胞的基因不能在原核细胞的受体细胞中正确表达,苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。 让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。 想一想需要做哪些工作？,普通棉花抗虫棉,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,目的基因的表达和检测,基因工程

3、的基本操作程序,1、什么叫目的基因： 主要指编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子。 如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因， 植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、 种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。,步骤一：目的基因的获取,与生物抗逆性相关的基因 与优良品质相关的基因 与生物药物和保健品相关的基因 与毒物降解相关的基因 与工业所需酶相关的基因 具有调控作用的因子 ,目的基因的分类,.从基因文库中获取目的基因 . 人工合成目的基因 .利用PCR技术扩增目的基因,2、怎样获取目的基因,获取目的基因是实施基因工程的第一步,从基因文库中获取目的基因,将含有某种生物不同基因的许多D

4、NA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。,3.什么叫基因文库？,4.怎样构建基因文库？,鸟枪法：,反转录法：, 根据已知的氨基酸序列合成DNA法 直接合成法：,人工合成基因法,直接分离基因,限制酶,基因组DNA,基因重组,转化细菌,体外包装,(1)基因组文库(Genomic library),是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组后，导入受体菌的群体中储存，这个群体就称为该生物基因组文库。其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。,每个受体菌DNA分子都包含一段不同

5、的 外源DNA片段,获取方法直接分离法：,构建基因文库,包含该生物的所有基因,cDNA( 互补DNA)： 是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做这种生物的cDNA文库,(2)cDNA文库 (cDNA library),反转录酶,mRNA,cDNA,构建cDNA文库,包含该生物的部分基因,获取方法 反转录法,cDNA合成过程,第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。 第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA

6、。 第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。,基因组DNA文库,cDNA文库,基因组DNA文库与cDNA文库的比较,图书馆,国家图书馆,市图书馆,基因文库,基因组文库,部分基因文库,从基因文库中获取,(基因序列未知),目的基因的获取,基因组DNA文库,cDNA文库,基因组DNA文库与cDNA文库的比较,基因组文库：一般针对原核生物的基因，因为基因少而简单,cDNA文库：一般针对真核生物的基因，因为基因多而复杂,基因组文库和cDNA文库的构建比较,提问：你能推测出由mRNA反转录形成cDNA的过程大致分为哪些步骤吗？,第一步，反转录酶以RN

7、A为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA DNA杂交分子。 第二步，核酸酶H使RNADNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。 第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。,由mRNA反转录形成cDNA的过程,第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA DNA杂交分子。 第二步，核酸酶H使RNADNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。 第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。,蛋白质,mRNA,DNA,DNA,(3)根

8、据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：,上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？,操作简便广泛使用,工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因,专一性强,操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高,专一性最强,仅限于合成核苷酸对较少的简单基因,.如何从基因文库中找到所需要的基因？ 从基因文库中找到目的基因是一件比较复杂的事情，要根据目的基因已有的某些信息来进行。下面介绍一种根据基因的部分核苷酸序列找到目的基因的方法。 第一步，通过PCR方法将目的基因已知的部分核苷酸序列扩增出来，进行放射性同位素标记（也可以用别的标记方法进行，如生物素、荧光素等），即用标记了放射性同位素的目的DNA片段作为探

9、针，与扩增出来的DNA杂交。,第二步，将基因文库中的所有菌落转移至硝酸纤维膜上（也可以用其他类型的膜），然后，通过处理溶解消化掉细菌中的蛋白质，并使DNA固定在膜上。 第三步，按Southern (DNA与DNA分子)杂交的方法进行杂交。 第四步，在X光底片上出现黑斑的菌落，这表明这个菌落中含有所需要的目的基因（若选用别的标记方法，有阳性信号的菌落则含有所需要的目的基因）。 第五步，从该菌落中再提取目的基因。,依据：目的基因的有关信息。 如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性,从基因文库中得到目的基因的方法,哪些新技术能大大

10、简化基因工程的操作技术？,1）DNA自动测序仪： 2）PCR技术：,对提取出来的基因进行核苷酸序列分析。,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。,PCR技术扩增目的基因,加热变性,退火复性,延伸,PCR循环,PCR技术,高温变性,中温延伸,低温复性,PCR,过程,变性、退火、延伸、循环四步曲,1.变性：加热至9095双链DNA解链成为单链DNA 2.退火：冷却至5560部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合（形成局部双链） 3.延伸：加热至7075以目的基因为模板，合成互补的新DNA链 4.循环拷贝：重复循环多次, 概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术,

11、条件：_、 _、_ (做启动子)、 _.前提条件：,原理：_,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循 环的次数）,结果：,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,已知基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,一对引物,DNA聚合酶,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,已知基因的核苷酸序列,3、利用PCR技术扩增目的基因,聚合酶链式反应,目的基因的获取,3、利用PCR技术扩增目的基因,聚合酶链式反应,目的基因的获取,聚焦二：目的基因的获取方法,5/,3/,5/,3/,高温变性,聚焦二：目的基因的获取方法,5/,3/,5/,3/,过程：,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模

12、板 在热作用下，_断裂，形成_,b、退火复性（55-65）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下， 合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,PCR扩增仪, 概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术,条件：_、 _、_ 、 _.等,原理：_,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循 环的次数）,结果：,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,四种脱氧核苷酸,一对引物,DNA聚合酶,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提条件）,PCR技术,过程：,

13、a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板 在热作用下，_断裂，形成_,b、复性（55-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从 引物的5端3端延伸，合成与模板互补 的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,TaqDNA聚合酶 TaqDNA聚合酶 是从一种栖热水生菌(Thermusaquaticus)yT1株分离提取的。yT是 一种嗜热真细菌，能在7075生长。该菌是1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离的。该酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，酶蛋白分子为 94KDa。其比活性为200000单位/mg。758

14、0时每个酶分子每秒钟可延伸约150个核苷 酸，70延伸率大于60个核苷酸/秒，55时为24个核苷酸/秒。温度过高(90以上) 或过低(22)都可影响Taq DNA聚合酶的活性，该酶虽然在90以上几乎无DNA合成， 但确有良好的热稳定性，在PCR循环的高温条件下仍能保持较高的活性。,在92.5、95 、97.5时，PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分别经130min，40min和56min后，仍可 保持50%的活性，实验表明，PCR反应时变性温度为9520sec，50个循环后，Taq DNA聚合酶仍有65%的活性。Taq DNA聚合酶的热稳定性是该酶用于PCR反应的前提条件，也是PCR反应能迅

15、速发展和广泛应用的原因。Taq DNA聚合酶还具有逆转录活性， 其作用于类似逆转录酶,此活性温度一般为6568，有Mn2+存在时，其逆转录活性更高。,PCR技术与DNA复制的异同,遵循碱基互补配对原则,模板、原料、能量、酶、引物、温度等,氢键在高温下断裂，双链全部解开,解旋酶催化氢键逐步断裂，边解旋边复制,体外,主要在细胞核中,DNA,RNA,热稳定DNA聚合酶（Taq酶）,解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等,在短时间内形成 大量的DNA片段,形成完整的DNA分子,PCR技术与DNA复制的比较表,碱基互补配对,四种脱氧核苷酸,模版、ATP、酶,DNA在高温下变性解旋,解旋酶催化,体外复制,热

16、稳定的DNA聚合酶(Taq酶),细胞核内,细胞内含有的DNA聚合酶,在短时间内形成大量的DNA片段,形成整个DNA分子,科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂 的过程和不懈的努力，才获得成功。 起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载 体质粒中（形成重组质粒），然后导入棉花的 受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。 然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子 (抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉 花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动 子、抗虫基因的重组质粒中插入终止子(抗虫 基因末端)，导入棉花受精卵，结果长成的植 株，有了抗虫能力。,资 料,步骤二：表达载体的构建,目的基因与运载体的结合过

17、程，实际 上是不同来源的基因重组的过程。,基因表达载体构建过程,第二步、.基因表达载体的构建：,它们有什么作用？,目的基因 启动子 终止子 标记基因 复制原点,标记基因,位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录mRNA，最终获得蛋白质,启动子：,位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断， 能终止mRNA的转录,标记基因,终止子,是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来,基因工程载体的构建需要考虑哪些方面的因素？道理何在？ 主要考虑以下几方面的因素。 （1）基因的特点：如果一个来自动物的目的基因含有内含子，就不能用于转

18、基因植物，因为动物中内含子的剪接系统与植物的不同，植物不能将动物基因的内含子剪切掉，只能用该基因的cDNA。基因的产物如果是一个糖蛋白，那么该基因在原核生物细菌中表达出来的蛋白就可能不具备天然状态下的活性，因为糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加上的，而细菌无这些细胞器。,（2）要选择强启动子或组织特异性启动子。启动子有强有弱，选择强启动子可以增加转录活性，使基因产物量增多。如果希望基因在生物的某个组织表达，如只在植物种子中表达，就要选择种子中特异表达的启动子。 （3）要有选择标记基因，如抗生素基因，以便选择出真正的转基因生物。,1.用一定的_切割 质粒，使其出现一个切 口，露出_。 2.用

19、_切断目 的基因，使其产生_ _。,填空：基因表达载体的构建, 核心,3.将切下的目的基因片段插入质粒的_处， 再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,质粒,DNA分子,限制酶处理,一个切口 两个黏性末端,两个切口 获得目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）, 核心,同一种,基因表达载体的构建,图解,想一想：其中有两个DNA片段连接形成的的产物有几种？,注意,载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构,用到的工具酶：

20、既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键,启动子、终止子对于目的基因表达必不可少,目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。,将所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？ 提示：有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。,步骤三：将目的基因导入受体细胞,转化,目的基因进入受体细胞内，并且在 受体细胞内维持稳定和表

21、达的过程。,农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 显微注射技术 感受态法,受体细胞,植物细胞,动物细胞,原核细胞,步骤三：将目的基因导入受体细胞,植物肿瘤,1目的基因导入植物细胞,（1）原理：农杆菌具有很强的趋化性，当植物体受损时，伤口处细胞分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA转移至受体细胞，并整个到染色体DNA上。,（2）受体细胞：受精卵或体细胞,（3）适用范围：,双子叶植物或裸子植物,原因：农杆菌对大多数单子叶植物没有感染能力,农杆菌转化法,适用于 双子叶植物 裸子植物,适用于 单子叶植物,基因枪法,胚珠,花药,花丝,柱头,花柱,子房壁,子房,雄蕊

22、,雌蕊,花粉管通道法,适用于 被子植物,2将目的基因导入动物细胞 方法：显微注射法 程序：,目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵） 显微注射 受精卵 新性状动物,3将目的基因导入微生物细胞 原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少 方法：,用Ca2+处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子,接种实验,抗原抗体杂交法,DNA-RNA分子杂交法,DNA分子杂交法,步骤四：目的基因的检测与鉴定,DNA分子杂交,采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列

23、的部位，仍然是两条游离的单链。,基因探针，是一段带有检测标记，且序列已知的，与目的基因互补的核酸序列。 基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。,DNA,附着在膜上,硝化纤维素,加探针,报告基因（含荧光素分子）,变性,DNA杂交 （如检测SARS病毒等）,a,b,c,d,检测,检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,方法,DNA分子杂交,Southern杂交DNA和DNA分子之间的杂交。目的基因是否整合到受体生物的染色体DNA中，这在真核生物中是目的基因可否稳定存在和遗传的关键。如何证明这一点，就需要通过Southern杂交技术。基本做

24、法是：第一步，将受体生物DNA提取出来，经过适当的酶切后，走琼脂糖凝胶电泳，将不同大小的片段分开；第二步，将凝胶上的DNA片段转移到硝酸纤维素膜上；第三步，用标记了放射性同位素（或生物素）的目的DNA片段作为探针与硝酸纤维素膜上的DNA进行杂交；第四步，将X光底片压在硝酸纤维素膜上，在暗处使底片感光；第五步，将X光底片冲洗，如果在底片上出现黑色条带，则表明受体植物染色体DNA上有目的基因。,DNA分子杂交示意图,采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离

25、的单链。,检测,检测目的基因是否转录出了mRNA,方法,分子杂交（注意与上不同之处）,Northern杂交DNA和RNA分子之间的杂交。它是检测目的基因是否转录出mRNA的方法，具体做法与Southern杂交相同，只是第一步从受体植物中提取的是mRNA而不是DNA，杂交带的显现也与Southern(DNA与DNA)杂交相同。,检测,检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法,抗原抗体杂交,Western杂交蛋白质分子（抗原抗体）之间的杂交。它是检测目的基因是否表达出蛋白质的一种方法。具体做法是： 第一步，将目的基因在大肠杆菌中表达出蛋白质； 第二步，将表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并

26、提取出抗体（一抗）； 第三步，从转基因生物中提取蛋白质，走凝胶电泳； 第四步，将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上； 第五步，将抗体（一抗）与硝酸纤维素膜上的蛋白杂交，这时抗体（一抗）与目的基因表达的蛋白（抗原）会特异结合。由于这种抗原抗体的结合显示不出条带，所以加入一种称为二抗的抗体，它可以与一抗结合，二抗抗体上带有特殊的标记。如果目的基因表达出了蛋白质，则结果为阳性。,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗原抗体杂交,用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA,个体生物学水平,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,思考与探究 1.作

27、为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？ 答：不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制条件，如启动子、终止子和标记基因等。,必须构建上述条件的主要理由是： （1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达； （2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录； （3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记； （4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控条件，如增强启动子等； （5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存

28、在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。,2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗？若想将一个抗病基因导入单子叶植物，如小麦，从理论上说，你应该如何做？,提示：农杆菌可分为根瘤农杆菌和发根农杆菌，在植物基因工程中以根瘤农杆菌的Ti质粒介导的遗传转化最多。根瘤农杆菌广泛存在于双子叶植物中。据不完全统计，约有93属643种双子叶植物对根瘤农杆菌敏感。裸子植物对该菌也敏感。当这些植物被该菌侵染后会诱发肿瘤。近年来，也有报道该菌对单子叶植物也有侵染能力。,根瘤农杆菌侵染植物是一个非常复杂的过程。根瘤农杆菌具有

29、趋化性，即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受伤组织集中。研究证明，主要酚类诱导物为乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因。近年来还发现一些中性糖，如L-阿拉伯糖、D-木糖等也有诱导作用。酚类物质和糖类物质既可以作为根瘤农杆菌的趋化物，又可以作为农杆菌中Ti质粒上Vir区（毒性区）基因的诱导物，使Vir区基因活化，导致T-DNA的加工和转移，从而侵染植物细胞。,需要注意的是农杆菌中不同的菌株，侵染能力有差别，在基因工程中需要加以选择使用。利用农杆菌侵染单子叶植物进行遗传转化时，是

30、需要加上述酚类物质的，同时单子叶植物种类不同，农杆菌侵染进行遗传转化的效果也有很大差异。 如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，但要注意两点：要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。,农杆菌主要有两种：根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）。根癌农杆菌能在自然条件下趋化性地感染140多种双子叶植物或裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。引发冠瘿瘤的原因是，Ti质粒上的T-DNA上有8个左右的基因在植物细胞内表达，指导合成一种非常特殊的化合物冠瘿碱，进而引起转化细胞癌变。而发根农杆菌则诱导产生发状根，其特征是大量增生高度分支的根系。,根癌农杆菌的Ti质