基因重组与基因工程.ppt

1、基因重组与基因工程,Genetic Recombination and genetic engineering,基因工程所采用的技术称重组DNA技术（DNA Recombination Technique）,含义：在体外应用人工方法进行基因重组， 然后把重组的基因导入宿主细胞，进 行复制、转录及翻译的过程。,重组DNA技术相关概念,1、克隆(clone) 原指由一个细胞经过无性繁殖以后形成子代群体的 过程。 基因工程中指一个亲本DNA分子产生无数个相同 DNA分子的过程。,获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性 繁殖。,（一）DNA克隆,2、克隆化(cloning),(1) 分

2、子克隆(molecular clone), 即DNA 克隆 ; (2) 细胞克隆； (3) 个体克隆（动物或植物）。,技术水平:,创造转基因动物,DNA克隆： 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增，提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。,DNA克隆目的: 分离获得某一感兴趣的基因或DNA; 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）。,基因工程的应用,基因载体 (cloning vector),概念

3、： 携带目的基因，实现其无性繁殖 或表达有意义的蛋白质所采用的 一些DNA分子。,载体具备以下条件:,1. 具有自我复制能力,拷贝数高,2. 具有多个单一限制性酶切位点,3. 具有选择性遗传标记,4. 分子量小，拷贝数高,5. 具有较高的遗传稳定性,按宿主分： 原核细胞载体：质粒、噬菌体 真核细胞载体：病毒载体,按来源分： 质粒(plasmid) 噬菌体(phage) 病毒(virus),载体的分类：,按用途分： 克隆载体(cloning vector) 表达载体(expression vector),穿梭载体(shuttle vector),克隆载体(cloning vector)： 能使插

4、入的外源DNA序列被复制、扩增 而不能表达，这样的载体为克隆载体。 表达载体(expression vector)： 使插入的外源DNA序列转录翻译，表达 出多肽链，这样的载体称为表达载体。,这类载体中含有来源不同的复制子结构，即具备原核细胞复制所需的序列结构，又具有能使外源片段在真核细胞表达所需的结构元件和相应的选择标记基因,所以能在原核细胞中复制并检测，克隆的外源基因在此类载体直接从一种受体转入另一种受体中进行表达,穿梭载体（shuttle vector)：,松弛型的复制子、多克隆位点、筛选标记。 常见:质粒、噬菌体,一、 克隆载体必需结构:, 概念: 存在于细菌染色体外的能独立复 制的双

5、链闭环的DNA分子。,（一） 质粒 (plasmid),细菌质粒, 分子量相对较小，能在细菌内稳定存在 能在宿主细胞内独立自主复制 具有某些遗传标志, 会赋予宿主细胞一些 遗传性状； 具有多个限制酶的单一位点（多克隆位点）, 质粒特点:, 质粒的复制类型：, 严谨型（strigent plasmid)： 复制与宿主染色体同步受宿主染色体复制的限 制，在宿主细胞中拷贝数 低约份拷贝。, 松弛型（relaxed plasmid): 复制不受宿主染色体复制的限制可独立复制，在 宿主细胞中拷贝数高，基因工程常用载体。,常用质粒载体种类： pBR322 pUC,pBR322:人工构建重要质粒,特点：具有

6、较小的分子量 具有两种抗生素抗性基因，可作 为筛选标记 具有高拷贝数 是松弛型质粒,pUC质粒优点： 具有更小的分子，更高的拷数 适于组织化学检测重组体,质粒携带外源基因,（二） 噬菌体(phage) : 感染细菌的一类病毒。,特点: 双链DNA分子（线性或环形） 两端具有12个nt单链互补粘性末端 具非必需区（中间区约1/3长度） 可在E.Coli中大量繁殖 可克隆15Kb左右的外源基因, 噬菌体DNA改造系统 gt系列（插入型，适用cDNA克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）,噬菌体(phage)载体系统分类：, M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因） M13mp系列,插入

7、型载体：外源DNA克隆到分子上，使噬菌体的某种生物 功能丧失效力，即插入失活效应 如：半乳糖酶失活的插入型载体（蓝白筛选）编码,A :载体中含一个LacZ基因 半乳糖苷酶 X-gal(无色) X(蓝色)+gal(半乳糖) *其中X为有色基因：（4-溴-5-氯吲哚）与gal结合 成无色的X-gal,B: 在含X-gal的培养基中，在Lac操纵子诱导物IPTG（异丙硫 半乳糖苷）作用下，细菌合成半乳糖苷酶，分解X-gal，此菌 落为蓝色。,(1) gt噬菌体,若Lac Z基因被外源DNA插入而破坏，则不能制造半乳糖苷酶，菌落为无色（白色）。,左臂,右臂,非必需序列,重组分子,左臂,右 臂,不能包装

8、的病毒颗粒,左臂,右臂,插入单一酶切位点 或一对内切酶位点,gt噬菌体DNA改造系统,(2) EMBL取代型载体（又叫替换型载体）,在DNA分子的中央，插入一段DNA片段： 具有多克隆位点的反向重复序列 当外源DNA插入时其可被置换掉 作用：提高了克隆外源DNA的能力。,结合质粒克隆载体和噬菌体克隆 载体的优点,结构：质粒DNA接上噬菌体 粘性末端(cos).,（3）粘性质粒 (cosmid)：,粘性质粒(cosmid),（1）大肠杆菌噬菌体 （2）基因组DNA全长6.5kb（单链） （3）感染后，可复制成双链DNA（RF，DNA） （4）当RF100200后，只有（+）链复制,2、M13噬菌

9、体（M13 phage）,动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，慢病毒，逆转录病毒）,（三）病毒载体：,酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC),（四）其它载体：,基因克隆的工具酶,限制性核酸内切酶 DNA聚合酶 DNA连接酶 逆转录酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶,一. 限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease, RE),(一) 定义 识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切 割双链DNA的

10、一类核酸水解酶。,+,Bam H,(二) 分类、作用,与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系 统：限制外源DNA，保护自身DNA，稳 定细菌遗传性状。,基因工程技术中常用型,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。,(三) 命名,EcoR,Escherichia coli RY13株 大肠杆菌 RY13株的第一种酶,(四) 类酶识别序列特点 回文结构(palindrome),切口：平端切口、粘端切口,Bam H,+,Hind,+,平端切口,粘端切口,黏性末端切割特点(sticky end) 5-黏性末端

11、: GAATTC EcoR 5 -G AATTC-3 CTTAAG 3 -CTTAA G-5 3-黏性末端： CTGCAG Pst 5-CTGCA G-3 GACGTC 3-G ACGTC-5,同功异源酶：来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。,+,Bam H,+,Bst,同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍末端(compatible end)。,Bam H,Bg l,+,+,二、 碱性磷酸酶,功能： 切除核酸5末端的磷酸基， 防止载体自身环化。,三、 DNA连接酶 (DNA lig

12、ase),功能: 催化DNA中相邻的5磷酸基和3羟 基末端之间形成磷酸二酯键，使 DNA切口封合或使两个DNA分子或 片段连接.,内切酶、碱性磷酸酶、连接酶的作用,四、 DNA聚合酶,基因克隆主要利用Klenow片断,标记探针的3末端,五、 TaqDNA聚合酶 (TagDNA polymerase),是一种耐热的依赖于DNA的D NA聚合酶，具有5 3聚合酶活性，该酶最适反应温度为75 80 ，无3 5外切酶活性，所以无校对功能。,六、 逆转录酶,七、 多聚核苷酸激酶,功能: 催化多聚核苷酸5羟基末端 磷酸化，或标记探针.,八、 末端转移酶,功能: 在3羟基末端进行多种核苷 酸多聚物加尾,基因

13、克隆的一般过程,目的基因的获得 载体的选择与制备 目的基因与载体的结合 重组DNA导入受体 重组体筛选和鉴定 重组体的扩增 目的基因表达、分离纯化,重组DNA技术操作的主要步骤,一、目的基因的获取,1. 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 2. 基因组DNA文库(genomic DNA library) 3. cDNA文库(cDNA library) 4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR),（一） 化学合成法获取目的基因,由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列,组织或细胞染色体DNA,基因片断,克隆载体,重组DNA分子,

14、含重组分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,基因组DNA文库： 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合,（二） 从基因组DNA 文库获取目的基因genomic DNA library,引物,cDNA 文 库,基于核酸杂交的筛选; 基于抗原抗体反应的筛选。,在文库中筛选目的基因原理,（四）聚合酶链反应获取 (polymerase chain reaction, PCR),利用DNA变性和复性原理，在体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法,包括变性、退火、延伸三步。,Cycle 2,Cycle 1,5,PCR基本工作原理,2530 次循环后，模板DNA的含量可以扩大

15、100万倍以上。,PCR的基本反应步骤,变性 95C,延伸 72C,退火 Tm-5C,模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+,PCR体系基本组成成分,三、目的基因与载体的连接,二、 克隆载体的选择与制备,经限制酶作用于目的基因与载体DNA，在连接酶催化下，来源不同双链DNA片段，断端重新形成，磷酸二酯键的过程,连接原理, 粘性末端连接 平端连接 一端粘性末端与另一端平端连接,连接方式：,方式： (1) 同一限制酶切位点连接 (2) 不同限制酶切位点连接,（一）粘性末端连接,Bam H切割反应,T4 DNA连接酶 15C,同一限制酶切位点连接,不同限制酶切位点的连接,Ec

16、o R切割位点,Bg l切割位点,定向克隆,在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。,同聚物加尾连接,由平端加上新的含有限制性酶切位点的接头，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。,人工接头(linker)连接,人工接头及其应用,适用于：限制性内切酶切割产生的平端或粘端补齐或切平形成的平端,T4 DNA连接酶催化平端连接,（二）平端连接,受体条件： 安全宿主 限制酶和重组酶缺陷 受体处于感受态(competent),四、 重组DNA导入受体,感受态(competent) : 指细胞在一定的生理状态可

17、摄取外源性遗 传物质经体内重组成为染色体中的一部分, 导 致受体细胞某些遗传性状的改变。经人工处理 能吸收重组DNA分子敏感状态的宿主细胞， 称之为人工感受态细胞。, 转化 (transformation)： 以质粒为载体构建的重组DNA分子导 入原核细胞的过程.,（一） 重组DNA导入大肠杆菌,1. CaCl2转化法 2. 电穿孔法,1、 CaCl2转化法,宿主：大肠杆菌 感受态细胞（Competent Cell）：E-coli经CaCl2处理（0-5），使细胞膜通透性增加，从而具有摄取外源DNA的能力。,转化程序： 感受态细胞+质粒DNA 42、90sec 不含抗生素的培养基热休克 37

18、涂布选择性平板 37 得到细胞的克隆 30-60min （合适抗生素） 10hr （使质粒扩增）,2、电穿孔法 (Gene transfer by electroporation),3、体外包装感染法(infection): 以人工改造的噬菌体或病毒为载体构建 重组DNA分子,经体外包装成具有感染性 噬菌体或病毒颗粒后,借助于噬菌体或病 毒的蛋白外壳将重组DNA分子注入细菌 或真核细胞,从而使目的基因得以复制的 过程.,（二）重组DNA导入哺乳动物细胞,1、DNA-磷酸钙共沉淀法 2、病毒感染法 3、显微注射法 4、脂质体介导法,Viral vectors （ SV40 viral vecto

19、rs）,显微注射法（microinjection）,将外源基因通过毛细玻璃管，在显微镜下注释到受精卵的细胞核内的方法。,基因枪法 (Biolistic-bombardment,Liposome-mediated gene transfer（lipofection）,（五）重组体的筛选与鉴定,（1）遗传学方法 （2）免疫学方法 （3）分子生物学方法,(1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 噬菌斑筛选,1. 遗传学方法,2. 免疫学方法 如免疫化学方法及酶免检测分析等,3.分子生物学方法 （1）限制性内切酶图谱 （2）核酸探针杂交 （3）PCR （4）双脱氧

20、终止法测序（sanger法）,(插入失活法) 抗药性标记选择, 互补的检测,鸡的肌球蛋白的克隆和检出,原位杂交,核酸杂交,重组DNA技术操作的主要步骤,以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程,重组DNA技术操作过程可形象归纳为,小 结,第五节 克隆基因的表达,外源基因的表达：,外源基因的表达涉及目的基因的克隆、复制、转录、翻译、蛋白质产物的加工及分离纯化等过程,将外源目的基因克隆到表达载体上，导入受体细胞的过程称为外源基因的表达。,表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离纯化,外源基因的表达步骤：,原核表达系统就是将克隆的外源基因导入原核细胞，使其在细胞内快速、高效地表达基因

21、产物，主要有大肠杆菌、芽孢杆菌及链霉菌系统等,一、外源基因在原核细胞中的表达,E.coli表达体系最为常用 组成：选择标志 强启动子 翻译调控序列 多接头克隆位点,原核表达体系,表达载体pETA 的物理图谱,不宜表达真核基因组DNA 不能加工表达的真核蛋白质 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusion body) 很难表达大量可溶性蛋白,E.coli表达体系的不足：,外源基因在原核细胞中的表达种类,1融合型表达蛋白,所谓融合型表达是指将外源目的基因与宿主结构基因相拼接构建成融合基因进行表达这样产生的蛋白质的N末端为宿主基因序列（可以是原核DNA或其它DNA序列）编码，C末端由外源目的基

22、因编码。,2非融合型表达蛋白,是指外源目的基因不与宿主基因融合，直接从起始密码AUG开始在原核调控元件控制之下表达外源基因蛋白质。,非融合型表达的蛋白质具有类似天然蛋白质的结构，其生物学功能也更接近于体内的天然蛋白质。但其缺点是容易被细菌蛋白酶降解。,3分泌型表达蛋白,分泌型表达是利用具有信号肽编码序列的分泌型表达载体，将表达的蛋白质由细胞质跨膜分泌到细胞外, 强启动子及其调控序列、 SD序列 SD序列下游携带有一段信号肽序列。 常用的信号肽有OmpA、PelB、PhoA 和Hly等。,分泌型表达载体组成:,需注意是，不同蛋白质的分泌需要不同的信号肽,大鼠胰岛素原cDNA 的表达和分泌,克隆基

23、因含有: 原核克隆载体的复制子 抗性筛选基因 限制性内切酶酶切位点序列,真核表达载体：,真核表达载体大多是穿梭载体.,二、 外源基因在真核表达,表达基因 真核细胞的启动子、增强子、 剪接信号、转录终止信号 PolyA化信号 遗传选择标记等组件，,真核表达体系：,酵母、昆虫、哺乳类动物细胞,真核表达体系优点： 1、可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA可适当 修饰，表达的蛋白质产物分区域积累。,2、真核细胞具有翻译后加工系统，可进行糖基化、 磷酸化、乙酰化等修饰，使表达蛋白形成正确 的天然构象，具有完整的生物学活性。,3、某些真核细胞可将外源基因表达产物直接分泌 至细胞培养基中，简化了分离纯化的操作。,真核表达体系缺点： 操作技术难 费时 不经济,利用DNA重组技术生产重组人胰岛素,一、人胰岛素的生产方法：,（一）直接提取法,（二）化学合成法,（三）化学转型法,（四）DNA重组技术制备法,第六节 重组技术与医学的关系,（一）疾病基因的发现与克隆 根据基因定位克隆疾病基因,并研究其性质，而认识疾病的分子机制。,（二）生物制药,重组DNA医药产品,(三) 基因诊断,基因诊