肠球菌氟苯尼考耐药相关基因的检测.ppt

1、肠球菌氟苯尼考耐药相关基因的检测,杨文哲 2008届药物制剂2班,前言 材料与方法 结果 分析与讨论 参考文献,前言,20世纪80年代以来，肠球菌严重感染的发生率和病死率明显升高，并且由于肠球菌的固有耐药和获得性耐药，使许多常用抗菌药物在治疗肠球菌感染时失败。 氟苯尼考耐药肠球菌的出现引起了越来越多专家的关注，其相关耐药基因fexA,fexB,cfr。 本次试验是通过检测这些耐药基因，为研究氟苯尼考耐药肠球菌的流行病学特征提供依据。,肠球菌为圆形或椭圆形、呈链状排列的革兰阳 性球菌，无芽胞鞭毛，为需氧或兼性厌氧菌。,材料与方法（1）,菌株： 29株肠球菌样品(牧医工程学院实验室分离保存)。 试

2、剂：氟苯尼考、 麦康凯培养基 、 琼脂糖 脑心浸出液肉汤（BHI） 细菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）等。 仪器：稳压稳流电泳仪 （DYY-4型） PCR扩增仪（2720型） 紫外可见透射反射仪（WFH-201BJ 型） 凝胶成像仪（AlphaImager EC 型） 立式压力蒸汽灭菌器（LS-B35L-I 型）等。,材料与方法（2）,方法步骤,菌株鉴定,耐药菌株筛选,基因组DNA提取,耐药基因检测,菌株分离,菌株分离,琼脂平板细菌划线法 融化培养基：麦康凯培养基放入立式压力蒸汽灭菌器中融化并灭菌。 倒平板：待培养基冷却至50左右，按无菌操作法倒平板(每皿约15m1)， 平置，待凝固。 分

3、区划线：在皿底将整个平板划分成四个面积不等的区域。各区之间的交角应为120左右。,菌株鉴定与耐药菌株筛选,鉴定：基因FG为肠球菌菌属所特有。通过特异性引物设计，基因组DNA提取，应用PCR扩增技术和琼脂糖凝胶电泳法，证实FG阳性或阴性来达到相应的目的。 筛选：配制氟苯尼考溶液1.3mg/ml，摇匀备用。在净化工作台上分装于29个BHI肉汤试管中，各16L，接种肠球菌菌株样品，置于37，190 r/min的摇床中过夜培养，观察是否有白色沉淀生成。,基因组DNA提取,进行菌株鉴定的29株肠球菌样本，以及筛选出的氟苯尼考耐药肠球菌均使用细菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）提取DNA ，按照说明书严

4、格进行操作。,耐药基因检测（1）,引物设计 根据GenBank公布的FG，fexA，fexB，cfr基因序列，采用primer premier 5软件进行引物自动搜索，并用Oligo6.0软件进行验证，最终设计出特异性引物，送英潍捷基（上海）贸易有限公司合成，见图表1。,耐药基因检测（2）,聚合酶链式反应 反应体系20 L ，模板2 L ，上、下游引物各1 L ，Taq预混酶10 L ，去离子水6 L 。PCR反应条件见图表2。,耐药基因检测（3）,琼脂糖凝胶电泳 将固态凝胶放入电泳槽中，加入TAE缓冲液至胶面以上1mm处；依次加入8 L PCR产物与2L 6 Loading Buffer的混

5、合物，DNA Marker DS2000作为标准，加入5L。电压100 V，时间30min。 结果观察与凝胶成像 将电泳凝胶进行紫外透射观察，使用凝胶成像分析系统凝胶成像，记录结果。,结果 （1）,鉴定结果 29株样本全为FG阳性，均属于肠球菌菌属。见图表3。 筛选结果 29株肠球菌样本中，10株为氟苯尼考耐药肠球菌，分别为N6、N7、N8、F7、F2、F5、N37、N39、N43、Z育4。,结果（2）,耐药基因检测结果,9株为fexA,fexB双阳性，1株为fexA,fexB双阴性，10株为cfr阴性。,分析与讨论(1),筛选后得到10株氟苯尼考耐药肠球菌，其分离率为38%。 基因fexA与

6、fexB在氟苯尼考耐药肠球菌中的检出率均为90%（9/10）,没有检出cfr，与试验菌株数量有一定关系。Corinna Kehrenberg报道cfr，fexA在氟苯尼考耐药葡萄球菌中的检出率为18%和55%，没有cfr,fexA,fexB在氟苯尼考耐药肠球菌中的相关报道。,分析与讨论（2）,fexB与fexA有59.7%的平均核苷酸同源性，设计的引物特异性可能会较弱，从而导致9株肠球菌中同时显示fexA,fexB阳性；然而，Corinna Kehrenberg有关于cfr和fexA在同一个质粒上的报道，因此也有fexA与fexB在同一个质粒上的可能性。 通过本次试验，再次证实了氟苯尼考耐药肠

7、球菌中的相关基因fexA和fexB，但没有验证这些耐药基因的具体位置，需要进一步做试验。,参考文献,Kehrenberg C, Schwarz S, Jacobsen L et al. A new mechanism for chloramphenicol, florfenicol and clindamycin resistance: methylation of 23 S ribosomal RNA at A2503J. Mol. Microbiol 2005;57: 1064-1073. Kehrenberg C and Schwarz S .Florfenicol-chloramphe

8、nicolexporter gene fexA is part of the novel transposon Tn558J. Antimicrob Agents Chemother 2005;49:813-815. Kehrenberg C and Schwarz S. fexA, a novel Staphylococcus lentus gene encoding resistance to florfenicol and chloramphenicolJ. Antimicrob Agents Chemother 2004;48:615-618. Shuangyang Ding, Qijing Zhang, Jianzhong Shen et al. A novel phenicol exporter gene, fexB, found in enterococci of animal originJ. Antimicro