《浸矿用细菌》PPT课件.ppt

1、,2.1 细菌的基本知识 2.1.1细菌的形态 球菌(Coccus) 杆菌(Bacillus) 螺旋菌(Spirlla) 其他形状的细菌,第二章：浸矿用细菌,2.1.1细菌的形态,细菌的分类,球菌(Coccus) 杆菌(Bacillus) 螺旋菌(Spirlla) 其他形状的细菌,球菌(Coccus),球菌,单球菌 双球菌 四联球菌 八叠球菌 葡萄球菌 链球菌,单球菌（显微镜下图）,单球菌(single coccus),双球菌(double coccus),双球菌（显微镜下示意图）,肺炎双球菌,四联球菌(Micrococcus lactis),四联球菌显微镜下示意图,电镜照片,八叠球菌(Sar

2、cina ureae),八叠球菌（显微镜下示意图）,尿素八叠球菌,葡萄球菌(Staphylococcus aureus),电镜照片(SEM) 显微镜下的金黄色葡萄球菌,链球菌,链球菌（显微镜下示意图）,链球菌（SEM照片）,杆菌（bacillus ）,显微镜下的杆菌示意图,螺旋菌（Spirlla),显微镜下的螺旋菌,幽门螺旋菌,左：显微数码摄像,右：结构示意图,特殊形态的细菌,2.1.2 细菌细胞的结构,细菌细胞的结构,细胞壁 细胞壁以内的构造原生质体 细胞壁以外的构造,（一）细胞壁（cell wall),a.细胞壁的结构 b.细胞壁的功能 c.细胞壁的化学组成 d.无壁细胞与原生质体 e.观

3、察细菌的方法,a.细菌细胞壁（cell wall）的结构,b.细胞壁的功能,固定细胞外形 协助鞭毛运动 保护细胞免受外力的损伤 为正常细胞分裂所必需 阻拦有害物质进入细胞 与细菌的抗原性、致病性和对噬菌体的敏感性密切相关,c.细胞壁化学组成,高等植物 纤维素,霉菌 几丁质,酵母 甘露聚糖，葡聚糖,细菌,肽聚糖,N乙酰葡萄糖胺 N乙酰胞壁酸 短肽,脂多糖,磷壁酸,d.无壁细胞细胞与原生质体,e.观察细菌的方法,(1) 观察工具 (2) 观察方法,(1)观察工具（tools）,普通光学显微镜（Microscope） 暗视野显微镜 相差显微镜 荧光显微镜 电子显微镜（SEM）,相差显微镜,其基本原理

4、：把透过标本的可见光的相位差变成振幅差，从而提高了标本内各种结构之间的对比度，使标本中 的结构清晰可辨；若观察生长在培养瓶中的生物细胞，则需应用倒置相差显微镜。它与相差显微镜基本相同，它的特点是物镜安装在载物台的下方，光源及长焦距聚光器安装在载物台的上方；可以对体外培养细胞进行长时间观察、拍照、摄电影及录像等以记录生活细胞的行为。,暗视野显微镜,暗视野显微镜由於不将透明光射入直接观察系统，无物体时，视野暗黑，不可能观察到任何物体，当有物体时，以物体衍射回的光与散射光等在暗的背景中明亮可见。在暗视野观察物体，照明光大部分被折回，由於物体(标本)所在的位置结构，厚度不同，光的散射性，折光等都有很大

5、的变化。,萤光显微镜,在萤光显微镜上，必须在标本的照明光中，选择出特定波长的激发光，以产生萤光，然后必须在激发光和萤光混合的光线中，单把萤光分离出来以供观察。因此，在选择特定波长中，滤光镜系统，成为极其重要的角色。 萤光显微镜原理： (A) 光源：光源幅射出各种波长的光(以紫外至红外)。 (B) 激励滤光源：透过能使标本产生萤光的特定波长的光，同时阻挡对激发萤光无用的光。 (C) 萤光标本：一般用萤光色素染色。 (D) 阻挡滤光镜：阻挡掉没有被标本吸收的激发光有选择地透射萤光，在萤光中也有部分波长被选择透过。,扫描是电子显微镜（SEM）,SEM特别适用於研究标本表面的细微构造 先标本表面先镀上

6、一薄薄的一层黄金l利用电子束扫描标本表面电子束激发了标本表面的电子被激发的电子被聚集后再聚焦於萤幕上（显现标本表面的形态） SEM的景深很深可供显示三度空间的形态 3.缺点： (1)先前用来处理标本的化学或物理方法会杀死细胞 (2)显微照片上会出现一些活细胞所没有的添加物,（二）观察的方法,细菌染色法,死菌,正染色,负染色：,简单染色法,鉴别染色法,革兰氏染色法,抗酸性染色法,芽孢染色法,荚膜染色法等,姬姆萨染色法,活菌: 用美蓝或TTC（氯化三苯基四唑）等作活菌染色,细胞壁与革兰氏染色,（二）细胞壁以内的构造原生质体,1.细胞膜（cell membrane） 2.细胞质和内含物(cytopl

7、asm andinclusion body) 3.核区(nuclear region or area) 4.特殊的休眠构造芽孢(endospore,spore),细胞膜（ cell membrane ）,细胞膜示意图,a:内嵌蛋白;b、c:内嵌蛋白或整合蛋白 d:外周蛋白;e:多酶复合体;f:脂双分子层,（三）细胞壁以外的构造,糖被（glycocalyx） 鞭毛 (flage,复flaglla) 菌毛（fimbria,复fimbriae ） 性毛（pili,单数pilus）,各种鞭毛的形态,2.2 浸矿用细菌,浸矿用细菌的分类：,中温细菌 中等嗜热细菌 高温菌,氧化亚铁硫杆菌（T.f） 氧化硫

8、硫杆菌（ T.t） 氧化亚铁微螺菌（L.f）,Thiobacillus caldus 嗜热铁氧化钩端螺菌（ L.t） 耐热氧化硫硫杆菌（S.f）,硫化叶菌 氨基酸变性菌,2.2.1 浸矿微生物种类,自养菌：在生长和繁殖过程中，不需要任何有机 营养，而是完全靠各种无机盐而生存的 这类微生物。 异养菌：需要提供现成有机营养才能生存的一类 微生物。 与矿物浸出有关的微生物大部分属于自养菌，某些异养菌也可以溶浸金属矿物，在生产中得到实际应用的主要是自养类微生物。,自养化能菌的特征,1)靠氧化培养基中的亚铁离子或硫化合物取得能量以空气中的CO2作为碳源，并吸收培养基中的氮、磷等无机盐营养，合成菌体细胞。

9、 2)菌的生活需要氧气，属于好氧菌，它们广泛生活于金属硫化矿和煤矿等矿山的酸性矿坑水中。 3)除利用的能源有差异外，其他性质都十分相近。,说明：,氧化硫硫杆菌、氧化铁铁杆菌和氧化铁硫杆菌三种自养菌的性能十分相近，而且难以将它们分开，所以有人视它们为一种菌，定名为氧化铁硫杆菌。,2.2.2 中温细菌,中温浸矿细菌中最重要的是矿质化学营养细菌，它们嗜酸 最适pH1.52.0 ,专性自养 ,最适生长温度为 25 35 .通常只存活一个星期左右，它可将硫代硫酸盐氧化成元素硫，又将元素硫氧化成硫酸。,2.2.2.1 氧化亚铁硫杆菌(T.f菌),(氧化亚铁硫杆菌Thiobacillus ferrooxid

10、ans简称T.f) T.f 菌被认为是酸性环境中浸矿的主导菌种, T.f菌主要代谢是氧化Fe2+为 Fe3+而获得能量,亦可氧化硫化矿物、元素硫、及可溶硫化合物 ,如硫代硫酸盐 ,甚至可氧化溶液中的一价铜离子及二价锡离子,并对溶液中的 Cu2+, Ca2+, Mg2+, Fe3+, Ag+, Au+等金属离子具有一定的耐受力 ,同时固定二氧化碳以生长。该菌种浸矿的适宜温度为 3035 ,温度过高或过低 ,其浸矿性能均下降。,T.f菌 的SEM 照片 ,图 T.f 菌 的一组SEM 照片 ,2.2.2.2 氧化硫硫杆菌(T.t菌),氧化硫硫杆菌(Thiobacillus thooxidans简称

11、T.t) 这种菌不能氧化亚铁离子,但能够生长在元素硫及一些可溶性硫化合物上,将浸出过程中产生的元素硫氧化。能增强浸矿作用。,图 T.t 菌 的SEM 照片 ,2.2.2.3 氧化亚铁微螺菌(L.f菌),氧化亚铁微螺菌( Leptospirillum ferrooxidans简称L.f) 1974 年 ,Balashova 等人从 Armenia 铜矿分离出L.f菌株 ,发现它只能氧化溶液中的亚铁离子 ,对元素硫及硫化矿物无氧化作用。,图 L.f 菌 的SEM 照片 ,2.2.3中等嗜热细菌,主要为硫杆菌属 Sulfobacillus 的 TH株系 ,在50 左右依赖黄铁矿、黄铜矿生长.绝大多数

12、需要酵母提取液或某种有机物为营养物. 1992年Golovacheva.R.S.等分离出微螺菌属的一种中等嗜热菌L.thermoferrooxidans，其适应温度范围为4550C，最佳pH为1.651.9，如图5所示 ，该菌螺旋状，有鞭毛，嗜氧，只能氧化水溶液与矿物中，属硫杆菌属，不能氧化亚铁，可氧化还原态硫。,图. 等嗜热菌L.thermoferrooxidans 的SEM照片,2.2.4 高温菌(Thermocidophiles),嗜酸嗜高温古细菌（Thermocidophili archaebacteria）是微生物进化的一个独支系，共四个种属能氧化硫化物，即：硫化叶菌(Sulfolo

13、lus),氨基酸变性菌(Acidanus),金属球菌(Metallosphaera)和硫化小球菌(Sulfurococcus)都极端嗜高温、嗜酸，球状无鞭毛，不游动，直径为1m，多分布在含硫温泉中。近年来，云南热温泉水中发现了一种高温菌，在65温度下浸出黄铜矿，其速率为氧化亚铁硫杆菌的6倍，其形貌如图6所示，是一种严格无机化能自养型嗜热嗜酸菌,图. 云南热温泉水中的高温菌（40000 ）,2.3 细菌的采集、培养与驯化,2.3.1 浸矿细菌的采集 目前 ,生物浸出中最重要的浸矿细菌是以转化还原态硫、亚铁为标志的两种类型的短杆菌属 。它们具有专性好氧 ,嗜酸性 ,以氨、硫酸盐、磷酸盐、钾、钙、镁

14、等无机物为养料 ,生长所需的碳和氧从空气中摄取等特性 ,是浸矿中必要的酸性介质和强氧化剂。这两种类型的细菌相对集中地存在于金属硫化矿、氧化矿以及煤矿的酸性矿坑水和土壤中 ,采集这类细菌的最佳采样点是铜矿、铀矿、金矿等有酸性矿坑水的地方。,a.采集地点,浸矿细菌可分布于土壤、水体及空气中，但较为集中的地方是金属硫化矿及煤矿的酸性矿坑水。所以采集这类菌的最佳取样点是煤矿、铜矿、铀矿等有酸性矿坑水的地方。如，矿坑水的pH值为1.53.5并呈棕色（说明有Fe3+存在），则很可能存在氧化铁硫杆菌。,b.采集方法,取50250mL细口瓶、洗净并配好胶塞，用牛皮纸包扎好瓶口，置于120烘箱灭菌20min，冷

15、却后可作为细菌取样瓶，带取样瓶到上述矿山取酸性坑水。,2.3.2 浸矿细菌的培养,(一） 培养步骤 1)配好的培养基用蒸汽灭菌15min后，在无菌操作下分装于数个已洗净并灭菌的100mL三角瓶中。 2)每瓶装培养基20mL，用洗净干燥吸液管分别取15mL矿水样加到三角瓶中，塞好棉塞置于2035恒温下，静置培养（或振动培养）710天。 3)细菌生长繁殖使三角瓶中培养基的颜色由浅绿变为红棕色，最后在瓶底出现高铁沉淀。,4)选择变化最快，颜色最深的三角瓶，在瓶中取1mL培养液，接种到装有新培养基的三角瓶中，同样培养。培养液将比头一次更快的变红棕色。 5)按同样办法反复转移培养10次以上。每转移一次只

16、需12滴，接种量逐渐减少而所培养的细菌却越来越活跃，只需培养35天就可把培养基中的Fe2+氧化为Fe3+。,（二）培养目标,在转移培养中，借助培养基的高酸度，可杀死淘汰掉一些不嗜酸的杂菌，同时由于培养基中的高浓度亚铁离子，只有氧化亚铁的细菌才能生长繁殖，其他菌则被杀死淘汰掉，而氧化铁硫杆菌则得到充分繁殖，活性越来越大。,（三）浸矿细菌的培养基,液体培养基 由水和溶在水中的各种无机盐组成的，液体培养基用于粗略地分离培养某种微生物。 固体培养基 是在液体培养基中加入1.5%琼脂（洋菜）或一定量硅胶制成的。 方法：在加热条件下配成一定浓度的消毒琼脂溶液后，再加入无菌过滤的FeSO4等无机盐母液，用H

17、2SO4调节好酸度，冷却至常温即制成固体培养基。 进行微生物的纯种分离则要用固体培养基。,常用培养基,1) 9K培养基:适用于培养氧化铁的喜中温细菌 ,其中 (NH4)2SO4) = 3 g/L,(KCl) = 0.1g/L, (K2HPO4) = 0.5g/L,(MgSO47H2O =0.5g/L, (Ca(NO3)2 = 0.01g/L , (FeSO47H2O) = 20 g/L。 2) 9K+ S 培养基:在 9K培养基的基础上加入一定量的硫粉 ,适用于培养氧化硫、氧化铁的喜中温细菌。 3) Waksman 培养基：适用于培养氧化硫的喜中温细菌，其中(NH 4)2SO4) = 0.2

18、g/L , (K2 HPO4)=3 g/L, (MgSO47H2O)= 0.5g/L, (CaCl26H2O) = 0.25g/L g/L, FeSO47H2 O痕量 , (S0 )= 2g/L。,培养基的测定方法及监测目的,1.测定方法 用 EDTA 对 Fe3+、Fe2+ 连续滴定测定;用精密酸度仪测定培养基的pH值。 2.监测目的 pH是反应介质酸碱性的重要指标。硫杆菌具有将还原态的硫转化成硫酸的功能 ,其发育会改变介质原有的酸性条件。通过监测 pH 的变化,可以判断硫杆菌的发育情况。Fe2+向Fe3+的转化标志着铁杆菌的活性状况。,（四）细菌的培养特征,菌落特征,细菌的其他培养,液体培

19、养 半固体培养,（五）氧化铁硫杆菌的检查和鉴定方法,1)肉眼观察 如有该菌生长，则培养基中的亚铁将被氧化变成高铁，培养基的颜色由浅绿变成红棕色，最后产生高铁沉淀。 2)重铬酸钾容量法测定 测定培养液中亚铁变成高铁的数量。变化快的，说明细菌生长旺盛。3)显微镜观察 观察细菌的形成，是否具有氧化铁硫杆菌的形状特征。 说明：上述方法得到的菌种是不纯的，如要分离纯种，上述分离过程要无菌操作，并且要作平板分离。,（六）平板分离,方法 1) 把配制好的固体培养基倒入培养皿制成平板。 2)在无菌操作下，用接种环取上述培养菌液在平板上划线分离，使所取菌液中的菌体细胞尽量沿划线分散开。 3)将划好的线培养皿在2

20、530条件下恒温培养。 4)经10天左右，借解剖镜挑选适当菌落并用取样针转移到装有数毫升培养基的小试管中恒温培养，一般7天左右培养液就可变成红棕色。 5)将此培养液重新在固体培养基上划线分离，如此反复进行数次分离和培养，就可获得纯菌株。,（七）细菌生长曲线,细菌生长 分成四个时期 生长缓慢期 对数生长期 稳定生长期 衰亡期 说明： 以上是所有微生物生长繁殖所必须经历的四个时期，每个时期的长短和细菌的活跃程度受环境因素制约。,a. 生长缓慢期,当细菌由一个环境转移到一个新环境时，会出现一个逐步适应的缓慢生长期，细菌生长繁殖速度很慢，细菌也不活跃。根据被培养细菌对环境的适应性，这个时期可能很短，也

21、可能较长。 比较正常的情况是24周 如果在含硫化铜培养基中培养，一般要24周 如果细菌的养料不变，则转移当中的的缓慢期就很短，甚至没有缓慢期。,b.对数生长期,随着细菌适应环境后，生长非常活跃，以对数增长的速度繁殖，此时细胞数目大量增加，对数生长期的曲线斜率就是细菌生长率： 这个时期新增加的细菌数目远超过死亡的细菌数。,c. 稳定生长期,细菌死亡数目和新生数目大致相等，总的细菌数维持恒定。这个时期培养器内细菌的绝对数是最多的。但此时培养基中营养大量消耗，细菌已变得不太活跃，当进入大量培养或用于生产接种时，应当使用稳定期内尽量靠近对数期的细菌。,d. 衰亡期,细菌开始大量死亡，培养器内总的细菌数

22、目急剧减少。此时培养基中的营养物质已基本消耗完。,(八）细菌的繁殖,细菌分裂过程,2.3.3 浸矿细菌的驯化,细菌的驯化：对细菌进行转移培养过程中逐渐变化外界条件，使对新环境不适应的细菌死亡，而某些活力较强的细菌会发生变异，演变成耐受性更强的细菌而活下来，形成新在耐性菌株。,1） 影响细菌生长的因素,（1）浸矿细菌的细胞膜类似于半透膜，可透过水分而对其他物质有选择性。细菌较其他生物细胞对渗透压的变化有较强的适应能力，但外界盐分浓度过高，会抑制细菌生长，甚至因渗透压变化过大，造成细菌死亡。 （2）重金属离子可使细胞蛋白质凝固，大部分重金属离子对细菌有毒性作用，超过一定限度，细菌会因细胞脱水而死亡

23、。 （3）非金属离子对细菌影响小些，但浓度过高也不行。如F-，细菌对它很敏感，浓度超过几个ppm就会严重抑制细菌生长,2) 驯化方法,在装有一定体积培养基的三角瓶中加入较低浓度的金属离子后，接种入要驯化的细菌进行恒温培养，待细菌适应能正常生长后，将它再转移到含有更高浓度金属离子的培养基中继续培养。依此类推，每转移一次都提高金属离子浓度，最终可获得对该金属离子具有较强耐性的菌株。,3) 驯化育种,在细菌浸出研究中所使用的细菌通常都要经过驯化 即将所要使用的细菌接种到所要浸出矿物的矿浆中或人工设计的类似环境中进行预培养 从而获得能够适应新的生长环境的细菌 . 驯化育种按目的不同 ,可分为活性驯化和

24、抗性驯化。方法是使用目的矿物不断转代培养或不断增加有毒离子的转代培养。比如：氧化亚铁硫杆菌耐离子毒性的能力分别是15g/LAs3+、119g/LZn2+、72g/LNi2+、30g/LCo2+、56g/LCu2+、160g/LFe2+。,4）驯化菌与非驯化菌的比较,从图 1 中可发现, 接种驯化菌的矿浆镍的浸出率在最初三天提高较慢，这是由于接种细菌量较少，矿浆中细菌初始浓度比较低所以浸出速率也较低。但是随着细菌的迅速繁殖，矿浆中的细菌浓度很快增大矿物的镍浸出速率也随之提高。 而接种非驯化菌的矿浆中镍浸出速率则始终比较低 显微镜观察发现其中的细菌数量很少且增长缓慢，而接种了驯化菌的矿浆中的细菌数

25、则很快增加直至达到一个最大值后才稳定下来. 从图 2 中也可以看出 接种驯化菌的矿浆 Eh 很快升高 在达到最高值后缓慢下降 而接种非驯化菌的矿浆 Eh升高较慢. 造成 Eh 升高的原因是矿浆中的Fe2+在细菌作用下被氧化成为Fe3+三价铁 细菌活性越高 Eh上升越快 由此确认驯化菌在矿浆中的繁殖速度和活性均大大高于非驯化菌.,驯化菌与非驯化菌浸出率比较,2.4 细菌对各种离子的抗性,2.4.1 阳离子对细菌的毒害作用 金属离子对细菌的毒害作用主要是使细菌生长的延滞期增长,从而降低金属的浸出率。 1） As3 +的影响 毒害机理:三价砷与蛋白质里的硫基反应使酶钝化,导致糖类耗尽 ,从而使细菌失去活性甚至死亡。 2）Ag+的影响 当Ag+ 浓度达到 50 g/L 以上时,对氧化亚铁硫杆菌有害 。Ag+ 浓度过高会产生很大毒害抑制浸矿细菌生长甚