生物化学资料：人血中血红蛋白的提取,纯化,与鉴定

1、人血中血红蛋白的提取,纯化,与鉴定08临床2班 一、 实验目的:1. 通过实验设计,对一学期来的生化实验所学到的内容作一次巩固.2. 培养自己对学术实验的一种独立的态度.二、 实验原理:人血中以红细胞为主,红细胞的中充满血红蛋白.人的血细胞中血红蛋白的含量较高.且含有的杂质蛋白较少.是提取血红蛋白理想材料.1基本原理是指混合溶质的分子按其分子量的大小不同，分别先后流出色谱柱而被分离。色谱分离中的固定相(凝胶)是一种不带电荷的、具有三维空间、多孔网状结构的物质，凝胶的每个颗粒的细微结构就如一个筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于凝胶颗粒之外，因而具分子筛的性质，因整个色谱过程一般不

2、变换洗脱液，好像过滤一样，故也称凝胶过滤色谱，又因使用的固定相为凝胶，故又称为凝胶色谱(gel chromatography；gel filtration chromatography; GFC)。凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。优点：a. 条件温和 b.操作简便 c. 损失少回收率高 d. 层析柱可反复使用,三、 实验仪器和试剂:试剂: 新鲜人血EDTA-Na 溶液 生理盐水 氯仿凝胶贮液（30ACr-0.8%Bis)分离胶缓冲液（3.0M pH8.9TrisHCl 缓冲液）浓缩胶缓冲液（ 0.5M pH6.

3、7TrisHCl 缓冲液）10%过硫酸铵 10%TEMED pH8.3Tris-Gly电极缓冲液 1%琼脂糖溶液0.05考马斯亮兰R2507%醋酸仪器:离心机层板柱,部分收集器,核酸蛋白质检测仪,记录仪双垂直板电泳槽、稳压稳流电泳仪四、 实验步骤: 粗提取, 血红蛋白溶液的制备取新鲜猪人液5ml加入0.5ml EDTA-Na 溶液中混匀离心,吸去上层血浆,用生理盐水将压红细胞做1:10倍稀释 (0.5 ml 红细胞压积+生理盐水 4.5ml ) 混合离心,(5000r/min , 10min ), 吸取上清液,如此洗涤3-4次,彻底除去血浆蛋白质.取洗涤过的1份压积红细胞,加蒸馏水1份和氯仿半

4、份,加漩涡混匀器振荡5min,然后离心5000r/min,10min, 除去细胞膜等残渣,吸取上层溶液. 纯化1、按图示排列将凝胶柱及各仪器连接好。（1）凝胶柱的出水口与紫外检测仪的进水口（打“”符号者）连接，通过软管将紫外检测仪的出水口（打“”符号者）与部分收集器连接；（2）用红、黑两条连接线将紫外检测仪与记录仪相连接“红接红”、“黑接黑”；2、依次打开紫外检测仪、部分收集器、记录仪开关，对仪器进行预热。3、通过“量程/零位”切换开关，设定记录仪的量程为“10mv”，取下记录笔的笔套，检查记录笔是否可书写。4、转动紫外检测仪右侧板上的波长旋钮，设定检测波长为280nm。5、打开凝胶柱出水口的

5、夹子，使洗脱缓冲液流经检测器。把“灵敏度”旋钮选择到“100%”档，调节“光量”旋钮，使检测仪窗口数字显示为100，即透光率为100%。再将“灵敏度”开关转到“0.5A”档，缓慢调节“调零”旋钮，检测仪数字显示为“0”，并使记录仪指针在“0”位。以上步骤需反复调节几次，待层析系统平衡后，即可加样检测。（注意：在样品检测的过程中，不可再调节“调零”、“光量”旋钮！）6、完成以上步骤后，进行流速检测，记下凝胶柱中洗脱液流出2ml所需的时间，并以此时间对部分收集器进行定时。7、部分收集器的使用：（1）按下“手动/自动”键，使收集器处于“手动”状态，在此状态下设置定时时间；（2）按“选择”键，每按一次

6、移动一位，根据第6步的结果设定定时时间。当数字闪烁时，可通过“置数”键设置该位的时间，时间设定后再按一次选择键，即完成定时时间的设定。（注意：定时的时间单位为分钟，即本型号仪器的最小定时时间为1分钟）8、加样检测（1）打开驻上端的螺丝帽塞子，用滴管吸出层析住中多余的溶液直至液面与胶面相切。（2）沿着柱管壁将1ml人血红蛋白样品小心加入到凝胶床面上（注意不可将凝胶胶面冲起），打开出水口夹子，使样品溶液进入胶面内，直同时收集流出液，至液面与胶面相切时，将出水口夹紧。（3）按上述加样的操作，以洗脱缓冲液洗涤柱管壁两次，每次1ml。最后加入3-4ml洗脱缓冲于凝胶柱中，重新装上上口螺丝帽，柱进水管与架

7、上洗脱液试剂瓶相连。（4）打开凝胶柱出水口的夹子，使已设定好定时收集时间的部分收集器处于自动收集状态，并开动记录仪进行记录。记录仪走纸速度设定为2mm/min。 鉴定2. 制备分离胶 将混合后的分离胶溶液，用细长头的滴管加入平、凹玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约1 cm。用1 ml 注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层蒸馏水(约34 mm)，用于隔绝空气，使胶面平整。 约30-60 min凝胶完全聚合，则可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界线。用滤纸条轻轻去处多余的蒸馏水，注意不要破坏胶面。3. 制备浓缩胶将混合均匀后的浓缩胶溶液，用细长头的滴管加入玻璃板的窄缝内(即分离胶上

8、方)，距短玻璃上缘0.5 cm处，轻轻加入样品槽模板（梳子）。梳子需一次平稳插入，梳口处不得有气泡,梳底需水平。静置电泳槽，10 min左右，上胶即可聚合，再放置10-20 min。4 . 电泳槽装置将凝胶板从制胶架中取下安装到电泳槽上，在凹板口边缘与电泳槽之间封一些琼脂糖。加入电极缓冲液，使液面没过凹玻璃板约0.5 cm。轻轻取出样品槽模板（梳子），即可加样。5 . 电泳将电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接。（红连红，黑连黑）。打开电泳仪开关，将电压调至最大，调整开始时电流为10 mA，待样品进入分离胶后，将电流调至20-30 mA，当溴酚蓝染料距硅胶框1 cm时，停止电泳，关闭电源。5

9、.染色与脱色电泳结束后，取下凝胶模，卸下硅胶框，用不锈钢药铲或镊子撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记。加入染色液染色5min(80oC) ，染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色(80oC) ，直至蛋白质区带清晰，即可观察结果及计算相对迁移率。9. 结果处理观察记录电泳结果量出加样端距溴酚兰的距离(cm)以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离(cm)，按下式计算相对迁移率mR: 相对迁移率mR=蛋白质样品距加样端迁移距离(cm)/溴酚蓝区带中心距加样端距离(cm)五、 实验预期结果:在最初粗提取的血红蛋白,肉眼可见蛋白颜色为淡红色.在凝胶过滤层析过层中,记录纸上会有几个,峰值,不过,只有最大的那个峰值才是收集到的血红蛋白.2聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳后,可见,有一条较为粗大明显的条带,为血红蛋白,和几条在其后面的的,不是很明显的小条带,是血浆中其它蛋白质,或者一些小分子3六、 参考文献:【1】戴亚