《生物化学》教学课件：重组DNA技术-2013-12-2

1、重组DNA技术 Recombinant DNA Technology,主要内容,DNA重组技术(基因工程)的概念 DNA重组技术的原理 DNA重组技术的流程 DNA重组技术的应用,又称分子克隆（molecular cloning）或基因克隆（gene cloning) 技术或 基因工程（genetic engineering）。 指在体外将DNA片段与载体连接，形成重组DNA分子，在受体细胞中复制、扩增或表达蛋白质以及定向改造基因结构所用的方法及相关的技术。,第一节 概述,重组DNA技术概念,2. 简史,1972年, P. Berg 将猿猴病毒SV40的DNA和噬菌体DNA连接, 获得构建第一

2、个重组DNA分子 (1980年获得Nobel 奖); 1973年, S. Cohen首次将DNA片段与质粒连接, 并转化入E. coli; 1982年, 第一个基因工程产品-人胰岛素(Ely LiLi公司), 在美国批准上市。,Paul Berg Stanford University,基因重组生产人胰岛素路线,人胰岛素,第 二节重组DNA技术中常用的 工具酶,限制性核酸内切酶-“DNA剪刀” * DNA连接酶-“缝纫针” * 聚合酶：DNA聚合酶、DNA聚合酶I大片段（ Klenow片段）、Taq DNA聚合酶 DNA修饰酶：多核苷酸激酶、 碱性磷酸酶、末端脱氧核苷酰转移酶（末端转移酶） 反

3、转录酶,常用的工具酶,常用的工具酶,一、限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶, 分为三型。,+,BamH,型限制性内切酶，在基因工程技术中常用。特点：分子量小，仅需Mg2+作为催化反应辅助因子，它们能识别双链DNA的特异序列，并在这个序列内进行切割，产生特异的DNA片段。 类酶识别序列特点为回文结构，一般为46 bp（有些为8或8个以上碱基序列)，且富含GC。,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写斜体； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写斜体； 第四个字母（

4、有时无）代表株（可大写或小写）； 用罗马数字表示发现的先后次序。,Hind ,Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第3种酶,命 名,E=Escherichia，埃希氏菌属 co=coli，大肠杆菌菌种 R=RY13，菌株名 I=第一个被分离到的内切酶,EcoR I,基本特性,1. 具有特定的识别和切割位点,识别位点举例（切割位点）,2. 识别的核苷酸序列通常为回文结构（palindrome）,Bam H,+,Hind,+,平端切口,黏端切口,3. 切割双链DNA分子后产生黏端或平端,（sticky end）,（blunt end）,平齐切开,平齐切开,错位切开

5、,平齐切开,来源与识别序列不同，但切割DNA后，产生相同的黏端，称为同尾酶。,Bam H,Bg l,+,+,4. 同尾酶（isocaudarner）,+,Bam H,+,Bst,+,Xma,+,Sma,来源不同但能识别同一序列（切割位点可同或不同）的两种酶互称同裂酶。,5. 同裂酶（isoschizomer）,6. 切割会受其他因素的影响 限制性内切酶通常不能切割在识别位点内有特异碱基甲基化的序列。 缓冲液或环境温度也会影响一些酶的特异性。 例如，EcoR I在正常情况下识别“-GAATTC-”序列，但在甘油浓度大于5%（v/v）或反应温度较低时识别序列可变为“-AATT-”或“-嘌呤嘌呤AT

6、嘧啶嘧啶-”，这种现象称为星号活性（star activity），以EcoR I*表示。,二、DNA连接酶,DNA连接酶（DNA ligase）：催化两个相邻的3-OH和5-磷酸基团形成3，5-磷酸二酯键，从而使DNA片段或单链断裂形成的缺口连接起来。,BamH I,1. 大肠杆菌染色体编码的 DNA连接酶 需NAD+作为辅因子 2. 大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的T4 DNA连接酶需ATP作为辅因子,DNA连接酶的来源,三、其它常用工具酶,碱性磷酸酶能水解除去核酸分子末端的磷酸基团 反转录酶以RNA为模板合成cDNA 末端脱氧核苷酰转移酶用于给DNA末端加尾以构成黏性末端 DNA聚合酶I主要

7、用于合成DNA DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)保留了有用的酶活性 Taq DNA聚合酶常用于PCR 多核苷酸激酶可使寡核苷酸链5羟基末端磷酸化,来自于大肠杆菌（bacterial alkaline phosphatase，BAP）或小牛肠（calf intestinal alkaline phosphatase，CIP）。用于脱去DNA（RNA）5末端的磷酸基团，使5-P成为5-OH，该过程称核酸分子的脱磷酸作用。,1. 碱性磷酸酶能去除核酸分子末端的磷酸基团,2. 反转录酶以RNA为模板合成cDNA,反转录酶 （reverse transcriptase）,反转录酶催化的cDNA合

8、成,RNA,RNA,5,3,AAAAAA,AAAAAA,TTTTTT,5,3,cDNA,cDNA,随机引物,Oligo-dT,5,3,5,5,3,3,5,3OH,GGG,GG,dGTP,末端转移酶,3. 末端脱氧核苷酰转移酶用于给DNA末端加尾以构成黏端,大肠杆菌DNA聚合酶I（DNA polymerase I）是基因工程中常用的DNA聚合酶。其除具有53聚合酶活性外，还有35及53核酸外切酶活性。因其具有53核酸外切酶活性而常用于DNA探针的缺口平移法（nick translation）标记。,4. DNA聚合酶I主要用于合成DNA,又称为Klenow片段（Klenow fragment）。

9、其保留了53聚合酶活性及3 5外切酶活性，失去了5 3外切酶活性。它具有的35外切酶活性能保证DNA复制的准确性，即把DNA合成过程中错配的核苷酸去除，再把正确的核苷酸接上去（该活性称为校对活性）。 Klenow片段的主要用途有： 补齐双链DNA的3末端，使其转变成平端；或通过补齐3端而使3末端标记； 在cDNA克隆中，用于第二股链的合成； 用于DNA序列分析。,5. DNA聚合酶I大片段保留了有用的酶活性,将黏端转变成平端,G,C T T A A,OH 3,5,3,5,GA A T T,C T T A A,5,3,3,5,对5-黏端片段，利用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，在3-O

10、H端延伸，可填平末端的凹陷并将其转变成平端。,DNA聚合酶,EcoR,将黏端转变成平端,C T G C A,G,5,3,5,C,G,5,3,3,对3黏端的片段，应用如T4 DNA聚合酶的35的 核酸外切酶活性可切去未配对的序列，将其转变成平端。,核酸外切酶,Pst,5,3,6. Taq DNA聚合酶常用于PCR,Taq DNA聚合酶具有良好的聚合活性和热稳定性，常用于PCR。该酶具有53聚合酶活性及53外切酶活性，但没有35外切酶活性，因而无35校对活性，故在PCR反应中如果发生碱基错配，该酶没有校正功能。针对此不足，目前研发出多种高保真耐高温DNA聚合酶，大大降低了PCR过程中的碱基错配率。

11、 另外，Taq DNA聚合酶具有末端转移酶作用，能在所合成DNA链的3末端加上一个单独的腺苷酸残基（A）。这样的PCR产物可直接与带有3-T的线性化载体（T载体）连接（即T-A克隆）。,7.多核苷酸激酶可使寡核苷酸链5羟基末端磷酸化,常用的是T4多核苷酸激酶（T4 polynucleotide kinase），该酶含5多核苷酸激酶和3磷酸酶活性，能催化ATP的-位磷酸向DNA和RNA的5-羟基转移。 该酶常用于： DNA或RNA的5末端标记； 使没有5-末端磷酸的DNA片段磷酸化，以供连接和克隆之用。,第二节 目的DNA的获取 Preparation of Interested DNA,一、化

12、学合成法可直接合成目的DNA,要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 应用：一般用于小分子肽类基因的合成,* 化学合成法获取目的DNA,由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列,色 苯丙 蛋 赖,第一步：构建基因组DNA文库（是指包含某一个生物细胞或组织全部基因组DNA序列的随机克隆群体，以DNA片段的形式贮存了所有的基因组DNA信息）。 第二步：筛选含有目的基因的克隆。,二、从基因组DNA文库中获取目的DNA,组织或细胞染色体DNA,基因片段,克隆载体,重组DNA分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶或机械剪切,受体菌,基因组DNA文库: 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组

13、DNA片段的集合。,* 从基因组DNA文库获取目的基因,三、从cDNA文库中获取目的DNA,第一步：构建cDNA文库，即包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经反转录而合成的cDNA序列的克隆群体，它以cDNA片段的形式贮存了全部的基因表达信息。 第二步：筛选含有目的cDNA的克隆。,cDNA文库: 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有cDNA片段的集合。,基因组DNA文库和cDNA文库的构建,从基因组DNA文库或cDNA文库中筛选目的DNA的策略 1. 菌落或噬斑原位杂交 2. 针对表达文库，可用抗原-抗体或配体-受体结合的原理（亲和筛选法）筛选,如果已经知道目的基因的序列，通过

14、设计引物，就能很方便地用PCR反应，从基因组DNA或cDNA中获得目的基因，可不必要经过复杂的DNA或cDNA文库构建过程。,四、经PCR获取目的DNA,第三节 DNA载体 Vectors,载体（vector）是指可供插入或携带外源DNA，实现外源DNA在受体细胞中的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子 。,按功能分,克隆载体（cloning vector）,表达载体（expression vector）,按基本元件的来源不同,质粒载体 噬菌体载体 黏粒载体 病毒载体 人工染色体载体等,概述,克隆载体(cloning vector)： 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载

15、体称为克隆载体。 表达载体(expression vector)： 为使插入的外源DNA序列可转录和翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。,一、克隆载体,（一）克隆载体应具备的主要特点,至少有一个复制起点（origin of replication, ori） 至少有一个选择性标志（selection marker） 有适宜的限制性内切酶的单一切点：称为多克隆位点（multiple cloning sites，MCS） 应有较高的拷贝数,pBR322质粒图谱,1. 质粒 (plasmid),特点：能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。,（二） 常用克隆

16、载体,严紧型质粒: 质粒与细菌染色体同步复制，处于 严密控制之下，其拷贝数较低。 松弛型质粒: 质粒的复制快于细菌染色体复制（即质粒复制不受严格控制），其拷贝数很高。重组DNA技术中使用的质粒通常是松弛型。 不同的质粒必须兼容才能共存于同一细胞中，这对复合转染（或转化）有参考价值。 目前，已有一系列商品化质粒克隆载体可供选择，如pUC系列、pGEM系列等。 质粒载体通常所能容纳的外源DNA长度在10 kb以内，外源DNA片段越长，质粒越不稳定。,噬菌体DNA改造系统： gt系列 EMBL系列,2. 噬菌体(phage),M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）： M13mp系列,3. 穿梭

17、载体（shuttle vector）,人工构建，含有不止一个复制起点，能携带外源DNA序列在不同种类宿主细胞中复制、扩增。,表达载体是指用来在宿主细胞中表达外 源基因的载体； 依据其宿主细胞的不同可分为: 原核表达载体（prokaryotic expression vector） 真核表达载体（eukaryotic expression vector）,二、表达载体,具备克隆载体的一般特点外，还需有调控外源基因有效转录和翻译的序列，如启动子、核糖体结合位点、转录终止序列等。原核表达载体的基本组成如下：,R：调节序列； P：启动子； SD：SD序列；TT：转录终止序列,大肠杆菌表达载体,（一）

18、原核表达载体,Lac启动子（乳糖启动子） Trp启动子（色氨酸启动子） Tac启动子（乳糖和色氨酸的杂合启动子） PL和PR启动子（噬菌体的左向和右向启动子） T7启动子,启动子 是启动外源基因表达的必需元件，其能被RNA聚合酶 所识别，目前原核表达载体常用的启动子有：,2. SD序列提供核糖体结合位点 mRNA在细菌中的翻译严格依赖于核糖体结合位点的存在。SD序列（Shine-Dalgarno sequence）位于转录起始位点上游813 bp处，为富含嘌呤的短片段，其能与核糖体30S小亚基中的16S rRNA 3端的部分序列互补结合。SD序列作为核糖体结合位点，保证了翻译起始复合物的形成。

19、,3. 转录终止序列 有助于外源基因的高效表达。转录终止序列长短不一，短的只有几十bp，长的可达几百bp。 转录终止序列有助于使RNA聚合酶重点转录克隆的外源基因，控制所转录RNA的长度，提高RNA稳定性。 位于启动子上游的转录终止序列可阻止其他启动子的通读，降低本底；位于多克隆位点下游的转录终止序列可防止因外源基因表达而干扰载体的稳定性。,4. 原核表达载体分类 依据表达目的蛋白的方式，可将原核表达载体分为： （1）非融合型表达载体 （2）融合型表达载体 （3）分泌型表达载体,（1）非融合型表达载体 指不与细菌的任何蛋白或多肽融合在一起进行表达 。,使用强启动子tac，紧接tac启动子的是多

20、克隆位点，目的基因克隆于启动子和SD序列下游。在多克隆位点下游包含一个很强的rrnB转录终止子，其作用是为了稳定载体系统，因为上游强的tac启动子控制的转录必须由强终止子抑制，以免干扰与载体本身稳定性有关的基因表达。载体的其余部分来自pBR322。,将一段特殊的蛋白质（或短肽）的基因构建入载体，使之与目的蛋白融合表达可形成融合蛋白（fusion protein）。 融合型表达载体，如pGEX系统。该系统载体使用强启动子tac，紧接启动子的是SD序列及其下游的GST基因，然后是多克隆位点。 用IPTG可诱导表达，表达产物与GST融合，故可利用该标签对蛋白进行纯化。,（2）融合型表达载体,优点：是

21、能把在受体细菌内表达的外源蛋白有效地分泌到周质腔，甚至穿过细胞外膜进入培养基中。 在构建该类载体时，除有一般表达载体应有的启动子等元件外，还需含有编码信号肽的序列（通常置于SD序列下游）。 可用于非融合蛋白的表达，也可用于融合蛋白的表达。 pIN 系列载体是较常用的分泌型表达载体，带有大肠杆菌中最强的启动子之一，即lpp（脂蛋白基因）启动子，其中编码信号肽的序列取自大肠杆菌中分泌蛋白的基因ompA （外膜蛋白基因）。,（3）分泌型表达载体,pIN 系列载体,（二）真核表达载体用于在真原核细胞中表达外源基因,真核表达载体包括在大肠杆菌中起作用的复制起始位点、抗生素抗性基因、多克隆位点等。,真核表

22、达载体中还具有： 真核表达调控元件：包括启动子、增强子、转录终止序列、poly A 加尾信号等 真核细胞复制起始序列 真核细胞药物抗性基因,OriPro：原核复制起始序列，可以在原核体系中扩增；P：启动子；MCS：多克隆位点；TT：转录终止序列；Poly T：产生Poly A尾巴；orieuk：真核复制起始序列。注：不是所有真核表达载体都有整合序列,真核表达载体的基本组成,真核启动子和增强子在不同类型细胞中的活性差别很大。某些来源于病毒的启动子和增强子，其真核宿主细胞范围较广，如Rous肉瘤病毒基因组长末端重复序列（long terminal repeats，LTR）、SV40病毒早期基因的启

23、动子和增强子、人类巨细胞病毒（CMV）启动子等。这些启动子和增强子组合可在广泛的宿主细胞中起作用，故在真核表达载体中被普遍使用。,真核表达载体带有的poly A 加尾信号可保证新转录的mRNA能有效地加上poly A。 为 mRNA 加上 poly A 依赖于mRNA 3末端的AAUAAA和其下游的GU或U富含区。 尽管全长cDNA克隆可能已带有AAUAAA序列和一段poly A，但这些序列仍不足以保证poly A的有效形成。因此，载体中必须带有poly A 加尾信号。 常用的来自SV40的poly A加尾信号为237 bp，其中同时含有针对早期和晚期转录子的切割和poly A 加尾信号。两套

24、信号作用的方向相反，并分别位于不同的DNA链上，对mRNA的加工均很有效。,酵母表达载体 昆虫表达载体 哺乳类细胞表达载体,根据真核宿主细胞的不同，真核表达载体可主要分为 ：,（1）酵母表达载体,根据载体在酵母细胞中复制方式的不同，可将酵母载体分为五类： YIp：酵母整合型质粒 YRp：酵母复制型质粒 YCp：酵母着丝粒型质粒 YEp：酵母游离型质粒 YLp：酵母线性质粒 除YLp外，其余各类既可在大肠杆菌，又可在酵母细胞中复制与扩增。,（2）昆虫表达载体,昆虫表达载体主要有两类： 杆状病毒表达载体 启动子为多角体蛋白(polyhedrin)基因的启动子，所使用的外泌信号序列来自蜂毒素mili

25、ttin的序列，其可在宿主细胞（如Sf9或Sf20）中高水平表达外源蛋白。 果蝇表达载体 启动子有Ac5（果蝇黑素激动蛋白5C基因）启动子和MT（果蝇黑素金属硫蛋白基因）启动子，所使用的外泌信号序列为Bip序列，其可连续表达或诱导表达外源蛋白。,（3）哺乳类细胞表达载体,据载体进入宿主细胞的方式分为病毒载体和质粒载体； 据载体在宿主细胞内是否整合于细胞染色体DNA，可将其分为整合型和非整合型载体； 整合型载体一般是随机整合入染色体，但所携带外源基因的表达受插入位点的影响，同时还可能会改变宿主细胞的生长特性，整合型载体通常用于外源基因的稳定表达；非整合型载体通常用于外源基因的瞬时表达； 最常用的

26、哺乳类细胞表达载体是病毒载体。,一个理想的病毒表达载体，应具备以下条件：, 使用安全，对宿主细胞无毒副效应； 能容纳较大的外源DNA片段且转染效率高； 所产生的病毒效价高； 外源基因在靶组织或靶细胞中能长期、稳定表达 病毒的靶向性强； 外源基因的表达具有可控性。 到目前为止，还没有任何一个病毒载体能满足以上 全部理想条件。,病毒表达载体由各种病毒DNA衍生而来，其构建时一般都把细菌质粒复制起点放置其中，使病毒载体及其所携带的目的DNA能方便地在细菌中繁殖和克隆，然后再转入真核细胞。 经过质粒化改建的病毒载体通常都包括病毒启动子、包装元件、遗传标记和质粒复制起点等几个部分。,常用的病毒表达载体包

27、括如下多种：, 反转录病毒（retrovirus, RV）载体 RV属ssRNA病毒； 构建RV载体时，将RV的DNA插入pBR322质粒，同时删除RV的三个编码基因，保留两端的LTR和病毒颗粒包装序列，再加入供筛选的标记基因。5LTR具启动子和增强子活性并具转录起始信号，3LTR具转录终止信号。 RV载体具有较高整合和表达外源基因的能力，广泛用于转基因动物和基因治疗研究，但因其随机整合，其安全性问题需加以考虑。, 慢病毒（Lentivirus, LV）载体 LV载体是以HIV-1（I 型人类免疫缺陷病毒）为基础发展起来的表达载体； 与一般RV载体不同的是，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能

28、力； 该载体可将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而获得持久表达； 该载体宿主细胞较广，在表达目的蛋白和小干扰RNA方面都有广泛应用 。, 腺病毒（Adenovirus, AV）载体 AV属线性dsDNA病毒； 目前，普遍使用的是AV第三代载体，载体中去除了所有AV的编码基因，仅保留了5和3末端反向重复序列（inverted terminal repeats，ITR）及病毒包装序列，病毒载体外壳的包装需要辅助病毒提供编码序列； 第三代AV载体能容纳较大的DNA片段，能较长时间地表达外源基因，其毒性和免疫原性都大大降低。, 腺相关病毒（adenovirus-associated virus，A

29、AV）载体 AAV属于线性ssDNA病毒； 构建AAV载体时，用外源基因及其调节序列取代病毒的rep和cap编码区，仅保留两端145 bp的ITRs，负责病毒的获救、复制、包装与整合；而辅助质粒则保留所有编码序列而无ITRs。两种质粒间无重复序列，重组AAV复制和壳化所需的rep和cap基因，由辅助质粒直接以蛋白表达方式提供，故不会发生野生型病毒序列的重组、复制和包装。当AAV载体与辅助质粒共转染辅助病毒（AV）感染的细胞时，即能获救、复制并包装成重组AAV 颗粒。 AAV载体具有能稳定表达外源基因、特异整合至人的19号染色体长臂末端、病毒稳定且宿主范围广、不引发免疫反应等优点 。, 痘苗病毒

30、（vaccinia virus，VV）载体 VV属dsDNA病毒； 构建VV载体时，通常以胸苷激酶（thymidine kinase, tk）基因作为筛选标志。tk序列中插有该病毒的早期启动子和下游的多克隆位点。含有外源DNA的重组VV载体的tk基因不表达，当与野生型VV共转染宿主细胞并经tk同源序列重组，便可获得既有外源基因又有tk基因的重组VV颗粒，进而导入tk缺陷的细胞后，可在含有次黄嘌呤、氨蝶呤和胸苷的培养基中筛选，只有tk表达的细胞才能生长。 VV载体具有克隆容量大（可插入2540 kb的外源DNA片段）、可插入多个外源基因、病毒宿主细胞广且使用较安全等优点。, 猿猴空泡病毒40（s

31、imian vacuolating virus 40，SV40）载体 SV40的基因组为双链环状DNA 人工构建的SV40载体主要有重组病毒质粒载体和取代型重组病毒载体两种类型，前者是将SV40基因组复制起点序列插入质粒载体中，从而构建成病毒-质粒载体；后者是用外源基因取代病毒基因组中与其大小相当的一个片段，从而形成取代型重组病毒载体, 单纯疱疹病毒（herpes simplex virus，HSV）载体 HSV为线性DNA病毒 构建HSV载体时，通常由型HSV基因组改建而成 目前，HSV载体主要有两类，一类是即刻早期（immediate early，IE）基因缺陷型载体，通过缺失这些IE基因

32、，降低了毒性，从而使外源基因表达时间延长；另一类是利用该病毒的扩增子（amplicons）制备的载体，该类载体仅含有HSV复制起点和包装序列以及调节序列。辅助质粒为装配型质粒，其除了缺失包装序列外，包含所有HSV基因组。两种质粒共转染宿主细胞后，产生感染性重组病毒颗粒，其中仅含有HSV基因组序列，所有与毒性相关的HSV蛋白均以低水平表达 HSV载体具有克隆容量大（可插入长达50 kb的外源DNA）、外源基因可获得稳定表达、整合入宿主基因组后无致癌危险、病毒宿主范围广且有较高的转移效率和效价, 其他病毒载体 除上述病毒载体外，目前用于构建真核表达载体的病毒还有人巨细胞病毒、脊髓灰质炎病毒等。此外

33、，还有人试图利用乙型肝炎病毒等构建真核表达载体。,四、载体上的常用标志或标签,通常用于重组子或阳性克隆的筛选、鉴定； 常见的标志有： 抗生素抗性基因 a.用于细菌重组子筛选的抗生素抗性基因 b.用于哺乳类细胞阳性克隆筛选的抗生素 抗性基因 酶的编码基因 营养缺陷选择标志,标签（tag）：其编码序列通常构建于表达载体，与目的基因位于同一阅读框内，这样就可使所表达的蛋白上带上标签肽。 标签肽大小不等，小的只有几个氨基酸残基，大的有几十kD。 标签肽常用于表达产物的分离、纯化与鉴定。 常用的tag序列包括： His：68个组氨酸 FLAG：八肽序列 Strep：链亲和素，八肽序列 HA：血凝素，九肽

34、序列 Myc：十肽序列 T7：11肽序列 S：14肽序列 HSV：11肽序列 VSV-G：11肽序列 GST SPA：葡萄球菌蛋白质A MBP：麦芽糖结合蛋白 GFP：绿荧光蛋白 RFP：红荧光蛋白 VSV：vesicular stomatitis virus，口蹄疫病毒,第四节 DNA克隆的基本过程,目的DNA的分离获取（分） 载体的选择与准备（择） 目的DNA与载体连接（接） 重组DNA转入受体细胞（转） 重组体的筛选与鉴定（筛）,DNA克隆的基本过程,基本步骤：,一、分离获取目的DNA有多种方法（分）,DNA克隆的第一步是分离获取目的DNA。 目的DNA的来源有多种，包括基因组DNA、经

35、mRNA反转录的cDNA、PCR扩增产物、化学合成法获得的DNA等。,二、根据DNA克隆的目的选择与准备适宜载体（择）,进行DNA克隆的目的主要有二： 获得目的DNA片段； 获得目的DNA片段所编码的蛋白质 针对第一种目的，通常选用克隆载体；针对第二种目的，需选用表达载体； 选择载体时，还要考虑目的DNA的大小、受体细胞的种类和来源等因素； 选择载体时还需注意载体内应有适宜的多克隆位点。,不同载体的克隆容量及适宜宿主细胞,三、目的DNA与适宜载体连接形成重组DNA（接）,（一）黏端连接为最适连接 1. 单一相同黏端连接会产生载体自连,单一相同黏端连接产生载体自连,单一相同黏端连接存在如下缺点：

36、 容易出现载体自身环化 目的DNA双向插入载体（即正向和反向插入） 多拷贝现象 采用碱性磷酸酶预处理线性化载体DNA，使之去磷酸化，可有效减少载体自身环化 目的DNA如果反向插入载体，虽不影响基因克隆，但却影响外源基因的表达,Eco R切割位点,Bg l切割位点,2. 定向克隆可有效避免载体自连和DNA片段的反向插入,定向克隆：将待克隆DNA分子和载体分子采用同一对限制性核酸内切酶切割后连接起来，可实现外源DNA片段的定向插入，此即定向克隆。,四、重组DNA转入受体细胞（转）,转化（transformation） 质粒或黏粒细菌 （感受态细胞，competent cell） 质粒酵母菌（真核细

37、胞） 转染（transfection） 外源DNA真核细胞（酵母除外） 噬菌体DNA感受态细菌 感染（infection） 噬菌体颗粒细菌 病毒颗粒哺乳细胞,受体菌条件： 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent),细菌的感受态（ competent bacterium）：细菌易于接纳外源物质的一种天然状态，在细菌的对数生长前期，为了分裂增殖的需要，细菌胞膜上会表达一些特殊的蛋白质，利于外源物质穿透胞膜，帮助细菌吸收外源营养物质。基因工程操作中，通过物理化学的方法也可使细菌处于感受态。处于该状态的细菌被称为感受态细胞。,将重组DNA转入受体细胞的常用方法：,化学法：氯化钙

38、化学转化 物理法：电击法、显微注射法 等,用氯化钙化学转化：,电击法,显微注射法,五、筛选与鉴定重组DNA有多种方法（筛）,一般一个载体只携带某一段外源DNA，一个细胞只接受一个重组DNA分子。最后培养出来的细胞群中只有一部分、甚至只有很小一部分是含有目的序列的重组体。将目的重组体筛选出来就等于获得了目的序列的克隆。 筛选与鉴定程序主要包括：先筛选出带有载体的克隆；然后筛选鉴定出带有重组载体的克隆；最后筛选鉴定出带有目的DNA的克隆。 主要筛选和鉴定方法有遗传标志筛选法、序列特异性筛选法、亲和筛选法等。,（一）用载体上的遗传标志可快捷方便地进行筛选,1. 利用抗生素抗性标志可筛选出带有载体的重

39、组子 将含有某种抗生素抗性基因的载体转入宿主细胞后，将细胞在含有相应抗生素的培养基中培养，无载体转入的细胞将被杀死，生长的细胞即是含有载体的细胞。至于细胞中的载体是否为含有目的DNA的重组载体，尚需进一步鉴定。,抗药性标志筛选,抗性平板,2. -互补筛选：利用了-半乳糖苷酶功能互补的基因片段。 -互补：pUC、pGEM及M13mp等载体系列均携带-半乳糖苷酶N端146个氨基酸残基（片段）的编码序列，在该序列中含有多克隆位点；经过改造的宿主菌基因组DNA含有-半乳糖苷酶C端（片段）的编码序列。只有当载体与宿主细胞同时共表达该酶的和片段时，才能形成有活性的-半乳糖苷酶，该现象称为-互补（alpha

40、 complementation） 。 -半乳糖苷酶可在诱导剂IPTG存在的情况下，使底物X-gal转变为蓝色产物，使细菌克隆或噬斑呈蓝色。当外源DNA片段插入载体的多克隆位点后，便不能表达片段，转化细菌后不能分解底物，结果使菌落或噬斑呈现白色。因此，-互补筛选又称蓝-白筛选 。,-互补筛选（蓝-白筛选）,（二）根据序列特异性可筛选出特定的重组DNA,根据序列特异性进行筛选的方法包括： 限制性内切酶法 PCR法 核酸杂交法 DNA测序法等,限制性内切酶法 针对初筛为阳性的克隆，提取其重组DNA，以合适的限制性内切酶进行消化，经琼脂糖凝胶电泳便可判断有无DNA片段的插入及插入片段的大小。同时，根

41、据酶切位点在插入片段内部的不对称分布，可用该方法鉴定DNA片段的插入方向；进而可用多种限制酶制作和分析插入片段的酶切图谱。,限制性内切酶图谱分析,目的序列插入载体会使载体DNA限制性内切酶图谱（restriction map）发生变化，如插入的目的序列中有其他限制性内切酶位点，也能在酶切电泳图谱上观察到。,2. PCR法 利用序列特异性引物，经PCR进行扩增，可直接检测目的DNA的存在，可鉴定出阳性克隆。 如果利用克隆位点两侧序列设计引物进行PCR，再结合序列分析，便能可靠地证实插入片段的方向、序列和阅读框的正确性。,3. 核酸杂交法 菌落或噬斑原位杂交（in situ hybridizait

42、on）。根据核酸探针标记物的不同，可通过放射自显影、化学发光、酶作用于底物显色等方法来显示探针的存在位置（即阳性克隆的存在位置）。常用于从文库中筛选目的DNA。,菌落或噬斑原位杂交,4. 核苷酸序列测定 主要有双脱氧链末端终止法和化学降解法，尤其以前者最为常用。 针对已知序列，通过测序可明确序列和阅读框的正确性；针对未知序列，可明确序列顺序，为进一步研究提供依据。 是最准确的鉴定目的DNA的方法 。,第五节 常用的表达体系 Expression Systems,一、原核细胞表达体系,原核表达体系主要以细菌作为宿主细胞，包括大肠杆菌、枯草杆菌、乳酸菌、沙门氏菌、苏云金杆菌等，其中又以大肠杆菌表达体系应用最为广泛和最成熟。原核表达体系既可用于原核基因表达，也可用于真核基因表达。,大肠杆菌 (Escherichia coli) 遗传背景清楚，基因工程操作方便，商品化表 达载体种类齐全，表达效率高； 不具备真核细胞的蛋白质复性系统，真核基因 在大肠杆菌中会合成错误空间构象的多肽链， 易形成包涵体(无正确折叠的立体结构)； 无真核生物的蛋白质加工系统，如糖基化、磷 酸化修饰等。,枯草杆菌 (Bacillus subtil