2临床基因扩增检验实验室质量管理和标准化：问题及思考.ppt

1、,临床基因扩增检验实验 室质量管理和标准化： 问题及思考,李金明,卫生部临床检验中心,全国基因扩增质量保证大会 2013.10.22-24 长沙,临床基因扩增检验实验室常规检测流程 标本采集、运送和 保存,实验室接收标本,扫条码 标本离心、开盖 加样器、核酸提取、 离心机、温育仪 扩增仪、杂交仪、 测序仪、芯片仪,结果分析报告 报告发出、用于疾 病诊断治疗,标 本 和,试 剂 准 备 仪器 设备 维护 校准,质控结 果分析,试剂 方法 的性 能验 证、 试剂 批质 检,信 息 系 统,哪些是影响质量的关键环节？ 瓶颈在哪里？,？, ,“We have a dream” “室内质量控制”？ “质

2、量监控指标”？ “质量追求”？ “室间质量评价”（“能力验证”）能带给我们 什么？ “无基因”和“无核酸”概念？ “灵魂”？ SOP的修改？ “精髓”？ “自由王国”？,我国临床实验室质量管理的发展 卫生部临床检验中心成立，其后各省市临床检验中心相继成立,1982年 2002年 2005年 2006年- 2010年, 临床实验室总体上的经验管理 室内质量控制和室间质量评价 临床基因扩增检验实验室管理暂行办法（卫医发 200210号） ISO15189认可(ISO 15189:2007. Medical laboratoriesparticular requirements for qualit

3、y and competence. Geneva: International Organization for Standardization, 2007. 医疗机构临床实验室管理办法卫医发200673号） 医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法（卫办 医政发2010194号）, ,明确指出临床分子诊断实验中防“污染”的重要性，以及“污染”的来源。 然后从实验室的组织和仪器设备、分析前、分析过程中和质量控制四个方面 做出详细规定。 该指南首次提出为避免污染，以PCR为检测手段的实验室应分为四个区，分 别为试剂准备区、标本制备区、扩增区和产物分析区。 在各分区的基础上，提出单一的工作流向和各区

4、物品不能混用等原则，并且 针对各分区的工作特点和防止“污染”的要求，对该区工作性质、工作流程、 穿着、仪器设备和使用耗材做出详细描述。 在该指南中还针对样本收集、运送环节中需要注意的关键点给出了防止“污染 ”并且保持样本稳定性提出了建议，以尽量避免由于分析前环节导致的假阳性 或假阴性结果。 在该指南的第三部分中，该指南分析了标本处理、逆转录及扩增、污染和产 物分析几个临床基因检测的影响因素，其中着重阐述了临床分子诊断实验的 大敌“污染”的来源及其防范措施。 该指南最后介绍了临床分子检测如何进行质量控制。,IFCC临床诊断中分子扩增方法质量评价基础指南简介 Neumaier M, Braun A

5、, Wagener C. Fundamentals of quality assessment of molecular amplification methods in clinical diagnostics. International Federation of Clinical Chemistry Scientific Division Committee on Molecular Biology Techniques. Clin Chem. 1998;44(1):12-26,项目,名,称,内,容,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14,CLSI/NCCLS

6、 MM1A CLSI/NCCLS MM2-A2 CLSI/NCCLS MM3-P2 CLSI/NCCLS MM5-A CLSI/NCCLS MM6 CLSI/NCCLS MM7-A CLSI/NCCLS MM9-A CLSI/NCCLS MM10-P CLSI/NCCLS MM12-P CLSI/NCCLS MM13-A CLSI/NCCLS MM14-A CLSI/NCCLS MM14-A2 CLSI/NCCLS MM16-P CLSI/NCCLS MM20-A,基因疾病的分子诊断方法 免疫球蛋白和T细胞基因重排检测 传染性疾病的分子诊断方法 分子血液病理学的核酸扩增检测 传染性疾病定量的分

7、子检测方法 医学遗传检测中荧光原位杂交方法 实验室诊断医学中的核酸测序方法 传染性疾病的基因分型 诊断用核酸芯片 分子诊断方法中标本收集、运输、处理和储存 分子诊断方法中的能力验证 分子检测能力验/室间质量评价设计 外源RNA对照用于基因表达检测 分子遗传检测的质量管理,美国CLSI制订的一些与分子检测有关的导则或指南,Charles Darwin,初级,中级,高级, ,目前，我们尚在何处？,Wehave a dream !,I,“室内质量控制”？, ,定义：由实验室工作人员，采取一定的方法和步骤，连续 评价本实验室工作的可靠性程度，旨在监测和控制本实验 室工作的精密度，提高本室常规工作中批内

8、、批间样本检 验的一致性，以确定测定结果是否可靠、可否发出报告的 一项工作。 一定的方法和步骤： 室内质控品检测？ 实验室环境条件？ 仪器设备维护校准？ 试剂方法性能验证？ SOP？ 人员培训？,如何发现实验室检测的质量问题？,“地震”之前的征兆,疾病如“阑尾炎”的症状及指标, ,右下腹反跳痛 恶心、呕吐 低烧 食欲不振 白细胞数增加等,实验室在质量上“患病”的可能症状 （质量监控指标）是什么？,实验室“质量监控指标”？, ,分析前：标本差错率、标本不合格率（凝块、 溶血、容器破损、标本量不够、超出允许时间 等）（可从自查、投诉等得到信息） 分析中：室内质控（真失控率、超出2SD频 率）、检测

9、阳性率、假阳性率、阳性结果连续 出现数、假阴性率、结果差错率、检测失败率、 仪器故障频率、标本的日检测量、仪器日和定 期维护的执行情况等等 。 分析后：报告及时率、报告差错率、报告遗失 率、报告召回率、医生和患者有效投诉率、纠 纷发生率等 。,实验室的“质量追求”？, ,（标本、数据）差错率?（95）？ 室内质控真失控率?（0.5）% 有效投诉率?（1.0）/每百个报告 ,设置“质量目标”的意义？ 目标: 是个人、部门或整个组织所期望的成果,目标是永远不变的吗？ 如果该实验室统计2012年的差错率为0.1%、报告及时率为98%、有效 投诉率为0.5/百个报告，原来定的上述质量目标还适用吗？如何

10、修改？,为什么要参加“室间质量评价（EQA）” ？, ,政府法规规定？ 三甲医院评审要求？ 自我教育（Self-education)？ 质量改进需要?,如何进行和使用“EQA”？, ,EQA样本应与临床标本同等对待同时检测（特 殊对待：重复多次检测、使用常规检测不用的 “好方法”检测等） EQA对实验室的质量改进作用：出现检测结果 不符问题寻找原因并评估对临床标本的检测 错误风险采取措施进行改进（仪器设备、试 剂、人员操作流程等） 能不能对EQA样本特殊对待？能不能与别的 实验室对结果？甚至直接采用厂家的结果？,“无基因”或“无核酸”,概念的重要性！,尊敬的李教授：,您好！ 来信请教一个问题，

11、具体情况 是这样的：我这儿使用的PCR仪是 ABI 7300，用的是达安公司的HBV- DNA试剂，去年12月中旬的一次试 验中发生了爆管事件，事件发生后， 已经按照SOP规程进行了消毒处理， 到现在已经有半年了，可还是不能 消除污染。PCR实验室在三楼，现 在即使加样操作放在同一幢楼房的 一楼进行，其余如混匀、温育、离 心等还放在原来的实验室，扩增也 在原来的实验室，阴性对照孔所加 对照都未如标本一样处理（因此暴 露在空气中的时间很短），可是阴 性对照孔仍有扩增，大约在21个循 环的时候开始，阴性对照显示的Ct 约为26左右。请问这是什么原因， 怎么处理才能消除污染。盼指点！ 刘X 2013

12、0508,刘大夫：PCR实验室一旦出 现严重污染，消除将会比较 困难，通常可采用下述方法： （1）开窗通风;（2）采用次 氯酸钠溶液擦地面及实验台 面，甚至墙面;（3）增长紫外 照射时间；（4）用75%乙醇 空中喷雾，然后用于次氯酸 钠溶液擦地面及实验台面。 上述措施每天都要进行，直 至污染消除。不知你是否按 上述方法进行？如没有，你 可以这样试，并请将效果告 诉我。 此外，在实验室出现严重污 染后，如还要进行工作，则 可临时更换一个厂家试剂， 应就可以。 20130508,李教授：您好！我是上次 向您请教PCR实验室污染 如何清除的小刘，我们按 照您的指点进行处理，现 在实验室污染已经完全清

13、 除，非常感谢！以后我们 会更加注意操作的规范及 相关知识的学习！ 2013.7.18,尊敬的李教授：,您好！您所说的措施我 都实行过，只不过除通风外， 其余措施仅实施过很少几次， 我将按您所说措施处理一段 时间再看看。另外，再请教 两个问题：（1）上述措施 要在三个区都进行吗？（2） 楼房第三层污染，在第一层 操作怎么也会受到影响？ 谢谢您拨冗指教！ 刘 X 20130508,实例：EGFR基 因突变检测出现 实验室“污染”,实验室质量管理的“灵魂”？,SOP等于试剂盒说明书吗？,标准操作程序（SOP）源于一些标准文件（如仪器 试剂说明书、国际国内标准文件）和实验室实际工 作经验积累。,因此

14、高于相关标准文件！,SOP是实验室的“最高标准”！,有可操作性的SOP是质量管理的“灵魂”！,“文字”加“图,片”的SOP能给 我们带来什么？,如何实现SOP的“可操作性”？,有一个SOP很容易,有一个可操作性的SOP很难吗？,SOP装订成册？,SOP的第一版、第二版、第三版、？,SOP文件在什么时候需要修改？,“修”一个东西的前提是这个东西一定 是出了“问题”或“故障”！,发现SOP有“故障”的途径：室内质控和室 间质评失控、差错、投诉、评审的不符合 项、, ,查出异因 采取措施 保证消除 不再出现 纳入标准 （SOP）,预防！,实验室质量管理的“精髓” 人是错误的来源？ 追根溯源往往是管理

15、上的问题！,出现问题怎么办？,防止同样的问题出现第二 次是质量管理的“精髓”！ 厦门公交要装自动爆玻器 按下按钮一推玻璃就碎 厦门买罐装汽油实名制 个人购买需开两份证明-搜狐新闻.htm,全面质量管理的工作循环:PDCA 4个阶段，8个步骤, ,第一阶段（Plan）有4个步骤： 分析并找出问题；找出问题产生的原因；确定最主 要原因；制定改进措施计划。 第二阶段（Do）有1个步骤：执行计划 第三阶段（Check）有1个步骤：检查计划执行情况。 第四阶段（Action）有2个步骤：总结、制定标准 （修改质量文件），以巩固提高；发现新出现的问 题，转入下一PDCA循环。 37,PDCA的特点,小环合

16、成大环,不断循环，阶梯式上升,“A”是改进的动力之源,38,A P C D,C D,A P,一个临床PCR实验室对全年,室内质控结果的分析举例,这次失控 反映的是 实验室的,什么问题？,Plan 问题：质控品 结果偏低 原因分析：对 出现失控的扩 增仪放置质控 的孔用沾蒸馏 水的棉签擦拭 后，结果正常。 最主要原因： 仪器维护问题？ 改进措施：每 天实验后，对 仪器各孔进行 擦拭。,Do 按照 新的 仪器 维护 SOP 执行,Check 是否有 同样的 失控发 生？ 是否执 行了新 SOP？,Action 总结， 并将扩 增仪孔 的擦拭 维护写 进维护 SOP。 是否出 现新的,问题？,HBV

17、 DNA检测质控失控发现质控结果超出均值3SD）,投诉实例1：标本不合格及仪器问题, ,肝病门诊方医生投诉患者谭XX 2009.6.29与 2009.7.13两次HBV DNA结果差异太大。 郭医生投诉患者唐XX 2009.7.10结果与患者临床 病情不符。,原因分析： 谭XX0629标本严重脂血。患者4月为小三阳，7 为大三阳。怀疑4月、7月标本是否来自同一人。 措施是以后脂血标本拒收。三查三对。 唐XX标本的原始检测有问题，将同一天其他患者 标本重测，发现2632-2639共8份原为阴性的标 本中出现6个阳性，联系工程师是当天仪器 （PE5700）阀门开关不正常，导致部分结果无 法检测荧光

18、造成假阴性。,患者 谭XX 唐XX,时间 090629 （标本2872） 090713 （标本3011） 090612 （标本2639） 090713 （标本3011,结 果 1000 （原始） 1000 （复查） 9.13108（原始） 5.4108（复查） 1000 （原始） 6106（复查） 1.6106（原始） 5105（复查）,实例3：因为标本质 检造成不同实验室检 测结果不一样。,问题：本实验室检测 KRAS结果错误,原因分析：重新切片， 并进行病理学评估， 去除正常组织，检测 结果与外院相同,最主要原因：检测时 未富集肿瘤细胞,改进措施：务必提取 DNA，对标本进行 病理学评估，富集肿,瘤细胞？,分析用质控（图）,控制用质控（图）,起来，不愿做,“奴隶”的人们！, ,不要做“质量管理”的奴隶！ “必然王国”：对“质量管理”及其规律还没有形成真正的认识，不能 自觉地支配实验室按质量管