2015第七章 病毒变异(1)

1、第七章 病毒变异,重点: 1.病毒变异的几种现象？ 2.导致干扰现象的原因 3.病毒突变的类型、定义及区别 难点: 1.DI颗粒的特征; 2. 错义突变 、表型混合; 3.分子内重组与重配,一.论述,遗传与变异是生物界不断发生的普遍现象，也是物种形成和生物进化的基础，微生物遗传学作为一门独立的学科，诞生于40年代，病毒遗传学作为微生物遗传学的重要组成部分，对于生物遗传和变异的研究起到了重要促进作用，也为分子遗传学的发展奠定了基础，病毒的许多生物学特性，包括结构简单，无性增殖方式，可经C培养,增殖迅速，便于纯化等，使其具有作为遗传学研究材料的独特优势。,大多数病毒具有明显的遗传稳定性，但由于病毒

2、不具有细胞的结构，其遗传变异易受周围环境的影响。特别是病毒以基因形式在细胞内繁殖，在繁殖过程中，病毒的核酸更易受细胞内环境的影响而发生改变，这就决定了病毒的遗传具有较大的变异性。,二变异现象,首先讲一下几种变异现象 ： 1.毒力变异：“毒力”表示毒株或毒型间病原性的差异（如NDV按毒力分为强毒型，中毒型，弱毒型），具体表现为所能感染动物，组织和C范围及其引起的症状、死亡率和病变的程度不同。 例如由感染动物，媒介昆虫或污染物等分离的病毒株，毒力常常不同（因而可从不同养殖场分离不同毒株做自家疫苗，例IBD分离）。某些自然分离株的毒力很弱，经过选育，常可用作疫苗毒株。,2. 抗原变异： 病毒抗原性差

3、别的表现。通常所谓的病毒“型”，实质上是病毒抗原性差别的表现，它们主要是用补体结合反应，沉淀反应，凝集反应以及中和试验等血清学方法鉴别出来的，那些具有许多“型”的病毒，大都也是易于变异的病毒，流感V和口蹄疫V是其中最显著的例子。,AIV：许多型;由16个血凝素H和9个N氨酸酶组合而成，98年香港流行H5N1,我国99-2015流行H5N2、H9、H7，可用其琼扩HA，HI。口蹄疫V：分七个型：O、A、C,SAT1(南非I型)SAT2,SAT3,和亚洲I型,不同型无交叉免疫性。,如流感病毒的变异，具体表现为表面抗原，它存在两种变化形式：抗原漂移和抗原转移,抗原漂移-是指病毒在自然宿主内频繁传代后

4、，所出现的抗原性微小变化。一般认为这是在免疫反应的压力下，突变体选择的结果。 抗原转移-是指病毒抗原性突发的巨大变化。一般推测这是基因重组的结果；也有认为这是由于量变的积累而导致质变的发生 。,流感病毒的抗原变异,3培养特性变异: V的所谓培养性状，主要指其在培养C上形成的蚀斑的形态和性质，实际上是V所引起的细胞病变的特征。各种V在组织培养C上产生的蚀斑性状，随V和C的种类不同而有一定差异（即使相似也有差异）。,而培养条件，例培养液和琼脂的成分和浓度，PH，二氧化碳张力以及培养的T和时间，甚至培养容器的种类等，也对蚀斑的产生和性状呈现明显影响,动物血清和琼脂（特别是琼脂中的硫酸多糖）对病毒的蚀

5、斑形成具有比较明显的抑制作用.,(1)蚀斑的大小： 决定于病毒的弥散和吸附率以及病毒在细胞内生长、成熟、释放的速度及其在细胞内外的死亡率等但亦随培养条件和时间而不同。,(2)蚀斑的色泽： 蚀斑的透明度和色泽取决于蚀斑及其周缘的细胞的死亡与溶崩情况，蚀斑中细胞完全溶崩时，蚀斑透明无色；而其中残留较多死亡和病变细胞时，蚀斑浑浊或呈白色。而其中存留较多活细胞时，蚀斑可因着染中性红而呈红色。 (3)蚀斑的形状： 蚀斑形状的规则与否，边缘是否清晰取决于病毒的弥散率及细胞的病变率。,4对温度感受性的变异,是指在较低温度下繁殖，但在较高温度下不能繁殖，而相应的野生型在这两种温度都能繁殖的突变体。,5. 对化

6、学药物的感受性变异 将盐酸胍、羟苯丙咪唑或盐酸金刚烷胺等病毒的灭活剂或诱变剂添加于已经接种病毒的细胞培养物，经过多次反复传代之后，可以获得对这些化学药物有抗性、甚至有依赖性病毒新变种。常因编码病毒酶基因的改变而降低了靶酶对药物的亲和力或作用，从而使病毒对药物不敏感而能继续增殖。 这种现象随着病毒化学治疗药物的增多，耐药现象可能将成为病毒化学治疗中一个需要充分注意和解决的问题,6. 营养变异 是指病毒对某种营养物质反应的变异。如一种病毒必须胱氨酸的存在才能形成蚀斑，当采用培养液中不含胱氨酸的细胞培养这种病毒时，可以选育得到不需胱氨酸甚至可被胱氨酸抑制的变异株。,一、突变的概念 病毒的突变（Mut

7、ation）是指基因组中核酸碱基顺序上的化学变化，可以是一个核苷酸的改变，也可为上百上千个核苷酸的缺失或易位。,突变 （Mutation）,二、病毒突变分类 一般分为自发突变和诱导突变。 （1）自发突变：是在没有任何已知诱变剂的条件下，病毒子代产生高比例的突变体，最后导致表型变异；病毒复制中的自然突变率10-5-10-8。DNA病毒和RNA病毒在突变频率上有较大的差别。,（2）诱导突变：是利用不同的物理或化学诱变剂（如温度、射线、5-溴尿嘧啶、亚硝酸盐等）处理病毒，提高病毒群体突变率，诱导病毒子代出现特定的突变类型。,三、突变的机理 从机理上，突变有两种主要类型，即位点突变，缺失突变。,一）位

8、点突变 (Point mutation） 病毒的基因组通过转录产生mRNA，后者转译成结构多肽或功能多肽。如果基因组的核苷酸碱基发生了改变，即会对多肽的特性产生影响。 3个碱基组构成一个遗传密码。一般地讲第3碱基发生了突变有时影响不大，如GGA，GGC，GGU，GGG，四个密码转译的氨基酸均为甘氨酸，此称无表型突变，假如密码中第一或第二个碱基发生改变，则转译的氨基酸就会发生改变,如：GGA（甘氨酸）变成GCA（丙氨酸）和AGA（精氨酸）等。,错义突变 ：某个氨基酸改变有时不影响pro构型和稳定性，在此情况下，基因组的表型仍维持原状，如果改变的氨基酸处于结构上的重要位置，那么多肽的正常功能就会丧

9、失。如GGA（甘氨酸）AGA（精氨酸）前者的侧链是中性的，而后者的侧链是碱性的。GGAGAA（谷氨酸），后者侧链是酸性的，这一转变导致多肽的构型发生严重影响，因而它的活性大为改变，如果是酶，则丧失了催化功能。,位点突变的特点,在单一核酸的碱基中发生了改变。 多数的点突变株为条件致死性突变株， 它只能在某些条件下增殖，但不能在另外一些条件下增殖 如：温度敏感突变株( temperature-sensitive mutation) ： 也称为ts突变株，其最高生长温度比正常病毒低。28-35可以复制， 37-40不能复制。如:脊髓灰质炎减毒活疫苗。,ts 突变株常具有减低毒力而保持其免疫原性的特点

10、，是生产疫苗的理想毒株。但ts 突变株容易回复,因此制备疫苗时须经多次诱变后，方可获得在一定宿主细胞内稳定传代的突变株，亦称变异株（variant）。脊髓灰质炎病毒活疫苗即为这种变异株。 位点突变引起的变种是多种多样的，还如空斑大 小的变种，酶缺陷变种;,二.缺失突变,这种突变中，病毒基因组的一部分被丢失，如果这部分核酸序列是无关紧要的，则病毒的表型不会受到明显影响，如果是关键部分，则病毒将失去独立繁殖的能力，甚至是致死性 。如缺陷性干扰颗粒(defective interfering paticle，DIP)。,某些条件下，如C培养中，接种大量病毒并连续传代，易感C被感染后只产生少量有感染性

11、的病毒粒子，而大量病毒粒子的基因组不完全,这种情况极普遍，几乎所有RNA病毒和大量DNA病毒各科都有发现，它们对同源的完全病毒有干扰作用。,DI颗粒的特征如下：,1.病毒接种量大（MOI高），并以此连续传代，DI颗粒逐增，而完整病毒逐减。 2.DI颗粒的产生也受宿主细胞种类控制。例NDV在CEF上传代时DI颗粒不断增多，而在鸡胚中则不易产生。,3. DI颗粒基因组不全，用核酸指纹图分析，核苷酸序列有各种各样的缺失。 4. DI颗粒形态与完全（整）病毒没有两样，沉降系数也变化不大，因此常污染于完全病毒制剂中，而不被察觉。,5. DI颗粒必须在完全病毒存在条件下，才繁殖，因它不能生产必须的全部功能

12、pro及结构pro。 6. DI颗粒干扰同源病毒完整粒子的生成机理尚未完全阐明，一般认为核酸链较短，因此复制的时间较快。 7. DI颗粒与病毒的持续性感染有密切关系，对动物体来说，DI颗粒可减轻发病，减少死亡，更有可能引起慢性带毒感染。,三 插入突变,在病毒基因组中插入一段核苷酸序列。,四 抑制性突变,突变的核苷酸有可能发生回复突变。也可能因为相同甚至不同基因发生抑制性突变(suppresser mutation)，使突变逆转，重新具有与起始毒株相同的表型。如流感病毒往往由于毫不相关的基因自行发生抑制性突变，使之失去作为弱毒疫苗的价值。,$2病毒间互相作用,一.遗传重组 指两种不同病毒间或同一

13、种病毒的两个不同毒株间发生核酸交换，子代核酸序列来自两个亲代，这种现象一般发生于分类上很接近的两种病毒。遗传重组有两种情况： 1.分子内重组：是两种不同、通常是密切相关的两种病毒的核酸序列的交换，DNA病毒可发生，RNA病毒也较普遍。,例如： 西部马脑脊髓炎病毒就是： 类仙台病毒 东部马脑脊髓炎病毒 不同科的病毒也可发生分子内重组。 如乳多空病毒和腺病毒 病毒与宿主细胞之间也可发生分子内重组。,2.重配：主要发现于节段病毒，当两种相近病毒同时感染一个细胞时，它们的基因组中有一个或几个节段发生交换。 如：人类的流感每隔十年左右引起一次世界性大流行，可能是由于人的流感病毒与某些动物（鸡、马、猪）的

14、流感病毒间发生基因重配所致。,重组recombination,重组,重配reassortment,3、复 活,交叉复活：有传染性的病毒与灭活的相关病毒或该病毒的DNA片段共同培养，产生具有灭活病毒特性的活病毒。 2)多重复活：例如用紫外线灭活的两株同种病毒,若一同培养后，常可使灭活的病毒复活，产生出感染性病毒体。 这是因为两种病毒核酸上受损害的基因部位不同，由于重组合相互弥补而得到复活。因此现今不用紫外线灭活病毒制造疫苗，以防病毒复活的危险。,二.表型混合,具有某些共同特征的两种病毒在混合感染时，有些子代的表型具有双方亲代特征，而基因型却无变化，这种现象称为表型混合。,例流感病毒和NDV等混合

15、感染同一细胞时，有些子代的囊膜抗原具有两种亲代病毒特征，囊膜病毒所显示的表型混合，可能是一个病毒的基因组偶尔装入另一病毒的衣壳内，或装入两个病毒成分构成的衣壳内，发生表型混合。这种混合是不稳定的，传代后可恢复其原来的特性 ； 缺陷性的罗氏肉瘤病毒的囊膜来自辅助病毒，这种里外不一致的病毒称为假型。,无囊膜的20面体病毒中也常发现表型混合，例如口蹄疫病毒与一种抗原性无关的牛肠道病毒混合感染，这种现象称为基因组掩蔽或衣壳交换 。 主要表现为耐药性，抗原性等改变，大多基因并未改变，改变的生物学性状不能遗传。,表型混合示意图,表型混合,三.互补 通常发生在两种病毒混合感染时，由于一种病毒为另一种病毒提供

16、其必需的但又不能自己合成的基因产物，而促进了增殖；或者两种病毒互为对方提供必需的基因产物，使双方的增殖均有所促进。,根据参与病毒的情况，分以下几类: (1)辅助病毒与缺损病毒的互补 (2)有活力病毒与灭活病毒互补 (3)两株条件致死突变体间的互补 (4)病毒内互补。,四.病毒间的非遗传相互作用,1干扰现象：发生于不同病毒间，也发现在同种病毒的不同毒株间，甚至发现在同种的灭活病毒与活毒之间。干扰机理可能不是单一的，下列原因都可导致干扰 ： (1) 细胞膜上的病毒受体被第一种病毒所破坏，因此第二种病毒不能吸附，这种现象一般发现在同种病毒之间。,(2) 第一种病毒封锁了第二种病毒mRNA的转译，或第

17、一种病毒的核酸复制酶使第二种病毒的基因组丧失功能。 (3)DI颗粒（第一节） (4)干扰素：这是由病毒感染的宿主细胞所产生的一种抑制病毒的可溶性糖蛋白。,2. 增强作用：在某些混合感染中，一种病毒可以增强第二种病毒的生长，这种反应不但见于两种互不相关的病毒间，也偶见于同种病毒的两个变异株之间。 在兽医中，牛瘟病毒可以增强牛丘疹性口炎病毒，猪瘟病毒在猪睾丸原代细胞培养中能增强NDV生长，此称END试验（猪肾原代细胞中培养的HEIC试验即血凝增加病变抑制试验），已被用于诊断NDV。有些DNA病毒能增强RNA病毒的生长。,3.互不干扰：两种不同的病毒如侵入同一个宿主细胞，可以各自独立地繁殖，各自产生特征性感染。,$3 缺陷V,第一节我们讲了DI颗粒是因缺失突变引起不完全病毒颗粒,而自然界中存在一些天生的缺陷病毒，它们在任何条件下都不能独立繁殖，必须依靠另一种病毒提供某些必需物质，因此后者称为辅助病毒，前者称卫星病毒，它们之间具天然协助关系。例如DNA病毒中细小病毒科的依赖病毒属，只有在腺病毒存在条件下才