第五章 动物细胞制药

1、生物技术制药,王丽萍 生命科学学院,第 五 章动物细胞制药,第一节 概 述,细胞学说的建立 组织培养和细胞培养 细胞工程学,第二节动物细胞的形态和生理特点,一、动物细胞的形态 适应功能,形态各异细胞的分化（特化） 离体培养细胞分两类： 贴壁依赖型细胞 贴壁非依赖型细胞, 贴壁细胞 生长须有贴附的支持物表面，自身分泌或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长。 两种形态： 成纤维细胞型梭型或不规则三角形 上皮细胞型扁平的不规则多角形,三、动物细胞的生理特点, 细胞的分裂周期长 细胞分裂时间为1248h， 细胞的分裂周期=间期+分裂期 间期（G1+S+G2） 分裂期（M）,G1期：凡细胞无增殖活动

2、时皆滞留在G1期 S 期：DNA的合成，一般为68小时 G2期：DNA量加倍，RNA合成和染色体螺旋化，持续时间短，一般为25h。 M期：一般持续时间很短，仅0.51h。相当于有丝分裂的中后期和末期，主要是染色体的变化、分裂，并形成子细胞。 细胞分裂代数与培养中的代数及相互关系。, 细胞生长需贴附于基质,并有接触抑制现象。 正常二倍体细胞的生长寿命是有限的。 原代培养 有限细胞系 无限细胞系 动物细胞对周围环境十分敏感。 对理化因素敏感，如： 渗透压、pH、离子浓度、剪切 力、微量元素等。,动物细胞对培养基要求高。 12种必需氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、葡萄糖、细胞生长因子、贴壁因子等。

3、 动物细胞蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同。 动物细胞蛋白质的合成部位： 游离核糖体 粗面内质网的核糖体,游离核糖体合成蛋白质用于细胞质基质内。 粗面内质网的核糖体合成蛋白质是分泌的和膜中的整合蛋白多为糖蛋白。,动物细胞生产药物 缺点:培养条件高、成本贵、产量低。 优点:分泌胞外、纯化方便、翻译后修饰糖基化，与天然产品一致。,第三节 生产用动物细胞的要求和获得,一、生产用动物细胞的要求 原代细胞 二倍体细胞系 转化细胞系 工程细胞系（融合或重组）,二、生产用动物细胞的获得, 原代细胞 是直接取自动物组织器官,经过粉碎消化而获得的细胞悬液（109/g）。 特点：生长分裂不旺盛 需要大量动物，

4、费钱费劳力。 应用：药物检测实验、药理研究 生产药品：鸡胚细胞、原代兔或鼠肾细胞、淋巴细胞。, 二倍体细胞系 原代细胞经过传代筛选克隆，从多种细胞成分的组织中，挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。 二倍体细胞有正常细胞的特点： 染色体组型是2n核型； 贴壁依赖接触抑制； 可传代培养50代； 无致瘤性。 生产药品：WI38、MRC5、2BS,转化细胞系 通过某个转化过程形成的，常由于染色体断裂变成异倍体，失去正常细胞特点，而获得无限增殖能力。 转化过程可以是自发的、人工的或从肿瘤组织中建立,4.工程细胞系,采用基因工程技术对宿主细胞的遗传物质进行了修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细

5、胞系。 方法： 正常细胞异倍体化；融合或重组。,三、常用生产用动物细胞的特性,1、人源细胞株系 W1-38：正常胚肺组织人二倍体细胞系。 核型为2n=46。成纤维细胞，贴壁生长 能产生胶原，培养基用BME（Eagle Basal medium）。 10%小牛血清，pH7.2,同工酶为G6PD B型。倍增时间为24h，有限寿命50代。安全，第一个被用于制备疫苗。,MRC-5：从正常男性肺组织中获得的人二倍体细胞系。 核型为2n=46。属成纤维细胞。 培养基用加小牛血清。 同工酶G6PD B型。 有限寿命4246代。增殖速度较W1-38快，对不良环境敏感性较W1-38低。对人的病毒敏感。用于生产疫

6、苗。,Namalwa：从肯尼亚淋巴瘤病人（Homo sapiens，human)中分离获得的类淋巴母细胞，含有部分Epstein-Barr病毒基因，但不表达完整的EB病毒。,悬浮生长，非整体核型，2n=1214，单X染色体，无Y染色体。培养基为RPMI 1640，添加7%胎牛血清。外源基因的表达水平较高，可用无血清培养基高密度培养。已成功地表达了rhEPO、rhG-CSF、tPA等，已用于大规模生产干扰素，并批准上市。,2、哺乳动物细胞株系 CHO-K1：从中国地鼠卵巢中分离的上皮样细胞。 核型： 2n=2022。 贴壁型生长，也可悬浮 培养基：DEME培养基 0.1mmol/L次黄嘌呤，0.

7、1mmol/L胸苷， 10%小牛血清， 加入脯氨酸。,BHK-21:从5只无性别的生长1天的地鼠幼鼠肾脏 中分离的。 成纤维样细胞,核型为2n=44; 培养基为DMEM加7%胎牛血清。 用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，现已用于工程细胞构建。,Vero：从正常成年非洲绿猴肾脏分离的。 贴壁依赖的成纤维细胞， 核型2n=60； 培养基为199培养基，添加5%胎牛血清。该细胞可支持多种病毒的增殖，包括脊髓灰质炎、狂犬病病毒，已被批准用于人体。,SP2/0-Ag14：通过融合的方法，从有羊抗红细胞活性的BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系P3X63Ag8融合杂交瘤SP2

8、/NL-Ag亚克隆中分离获得。 能耐受8氮鸟嘌呤 20g/ml但在含HAT 选择培养基中不能存活。 通常用培养基为DMEM，添加10%胎牛血清。 用于生产单抗杂交瘤细胞和抗体。,3、昆虫细胞株系 Sf-9: 1983年从亲代IPLBSF21AE中克隆形成。亲代细胞从秋粘虫的蛹卵组织中分离获得。它对苜宿尺蠖核型多角体病毒和其它杆状病毒高度敏感。 通常用的培养基为Grace培养基，添加3.3g/L 水解乳蛋白和3.3g/L酵母浸液, 10%胎牛血清。 用于高效表达外来蛋白制品。,Sf21：是从秋黏虫（Spodoptera frugiperda，fall armyworm)卵巢细胞中分离得到的，细胞

9、较大，容易放大，高效表达外源基因。 TN-5B1-4：是从粉纹夜蛾（Trichoplusia ni，TN）卵细胞匀浆中分离得到的，无血清培养，快速倍增。分泌表达重组蛋白的能力比SF9细胞系高20多倍，能适应悬浮培养。,四、基因工程细胞构建和筛选,在生产中采用更多的更有前景的是融合细胞及采用基因工程构建的各种工程细胞。,被用构建工程细胞的动物细胞有： CHO-dhfr 、BHK-21、 Namalwa、 Vero、 SP2/0、 Sf-9 等细胞。,载体： (1)病毒载体 牛痘病毒（用构建多价疫苗) 腺病毒、逆转录病毒(用于基因治疗) 杆状病毒(用于外源基因表达) (2)质粒载体 穿梭载体,腺病

10、毒的基因组DNA,ITR,ITR,E1,E2,E3,E4,IVa2,VA,L1,L2,L3,L4,L5,腺病毒基因组DNA全长36 kb，其包装上限为原基因组的105%， DNA两端各有一个反向重复序列（ITR）； E1-E4为早期基因，与病毒基因组的复制及晚期基因的表达调控有关，其中E3编码晚期基因的调控因子，E3区缺失只会影响病毒颗粒的成熟，不影响基因组的复制功能，因而在构建载体时往往除去这个2.2 kb的片段，使得载体的装载量提高到4kb以上,E1区负责病毒基因组的复制也常被删除，但有特殊要求。 L1-L5为编码病毒包装蛋白的晚期基因； IVa2和VA均为病毒RNA聚合酶的亚基编码基因。

11、,SV40的基因组DNA,t / T基因编码病毒的小抗原和大抗原与病毒的致癌作用密切相关.SV40在裂解宿主细胞前的晚期状态时，每个宿主细胞含有105个病毒DNA拷贝，十分适合用于高效表达外源蛋白,Apr,ori,gpt,SV40 ori,pV2-GPT,pBR322,SV40,pV2-GPT是一种SV40 DNA与大肠杆菌质粒DNA杂合的载体，其中gpt为细菌来源的谷氨酸-丙氨酸转氨酶基因，用于筛选重组子。该载体曾被成功地用于在猴肾细胞中表达有生物活性的兔b-珠蛋白.,重组的SV40 DNA分子必须经过包装后才具有感染能力，因此插入的外源DNA片段不能太大。为了尽量提高SV40的装载量，必须

12、删除一些基因片段，因此重组的SV40分子必须与野生型病毒共感染受体细胞，才能形成有感染力的重组病毒颗粒。,利用SV40 DNA载体表达外源基因的程序,SV40 载体,病毒晚期基因启动子,筛选标记,ori,缺陷的SV40 辅助病毒,去除细菌序列,插入外源基因,重组分子,分离病毒DNA,转化,筛选,增殖,感染,牛痘病毒,目前广泛使用的牛痘病毒表达系统是一种预先构建好的重组病毒,其基因组上插入了一个可表达的大肠杆菌T7RNA聚合酶编码基因。在外源基因导入受体细胞之前，先以上述的重组病毒感染细胞，使其大量表达T7RNA聚合酶，然后再将含有外源基因和T7启动子的细菌型重组质粒导入哺乳动物受体细胞，此时外

13、源基因整合在受体细胞染色体DNA上，并在T7RNA聚合酶的作用下表达出重组蛋白。,利用人牛痘病毒载体表达外源基因的程序,牛痘病毒 启动子,T7 RNA 聚合酶基因,T7启动子,外源基因,细菌重组质粒,感染,转化,培养,收集,杆状病毒作为载体的优点： 双链DNA，易重组 插入78kb DNA不影响正常病毒粒子的形成。 多角体蛋白和病毒粒子的形成无直接关系，因此用外源基因更换多角体蛋白基因，仍能形成有感染力病毒粒子； 多角体蛋白基因有非常强的启动子，产生的蛋白质可占全部蛋白质的20%30%；,用光学显微镜可看到多角体，可以此作为标记物，选阳性克隆。 如用家蚕杆状病毒，还可在蚕体表达外源基因。,穿梭

14、载体在细菌和哺乳动物细胞体内都能扩增。都含有如下基本成分： 允许载体在细菌体内扩增的质粒序列。 含有使基因表达的调控元件（TATA框和CAAT框）。 能用以筛选出外源基因已整合的选择标记。 neo基因，编码的氨基葡萄糖苷磷酸转移酶（APH）能使一种氨基葡萄糖苷类扩生素新霉素磷酸化而失活。 绿色荧光蛋白基因（GFP） 有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统。 二氢叶酸还原酶基因（dhfr）与目的基因重组在一起，培养基中添加氨甲喋呤时可提高表达量。,哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理,通过强化基因扩增高效表达外源基因,DHFR-MTX高效表达系统,外源基因,dhfr,转染dhfr -细胞系,单克

15、隆,培养,转移,0.05 mM MTX,培养,单克隆,转移,培养,单克隆,转移,5 mM MTX,0.25 mM MTX,培养,单克隆,外源基因扩增至100拷贝,基因载体的导入,基因载体导动物细胞常用方法是： 磷酸钙沉淀法 电穿孔法,磷酸钙沉淀法：溶解的DNA 加Na2HPO4和CaCl2 形成磷酸钙沉淀， DNA被包在磷酸钙沉淀中，形成DNA磷酸钙共沉淀物，当和细胞表面接触时，则通过细胞吞噬作用而将DNA导入。,电穿孔法： 借助电穿孔仪的高压脉冲电场，使细胞膜出现瞬时可逆性小孔，外源DNA沿小孔进入细胞。转化率较高，拷贝数低。,五、细胞库的建立 生产用的工程细胞必须建立两个细胞库： 原始细胞

16、库 生产用细胞库,原始细胞库贮存时须有该细胞的详细挡案，包括： 该细胞系的历史 该细胞系的特性 对各种有害因子的检查结果 生产用细胞库 从原始细胞库来的，或从单一安瓶来，或从多个安瓶来即刻混合，经培养扩增再分装储存形成细胞库。,需建挡案，进行无菌性无细胞交叉污染的检查。 需确定最高使用的传代数。,第四节 动物细胞的培养条件和培养基,细胞体外培养基本条件: 无菌 营养充足,防止有害物质 氧气 随时清除代谢有害物质 良好的生存外环境 及时分种,一、动物细胞的培养条件 器材的清洗和消毒 器材的清洗 浸泡、刷洗、泡酸、冲洗 器材的消毒灭菌 物理消毒 化学消毒, 水质 :电阻值大于18M,去热原。 pH

17、:7.27.4 渗透压:290300mOsm/kg 温度:370.5 C 空气:氧的饱和质60%,氧分压40.7kPa,二、动物细胞的培养基的种类和组成,分3类: 天然培养基 合成培养基 无血清培养基,天然培养基 血清、羊水、腹水等,成分复杂、 成分不稳定 合成培养基 DME、 MEM、 DMEM、 HAM F12、 RPMI1640,氨基酸 维生素 糖类 无机盐 其它成分 添加小牛血清：,添加小牛血清的作用 提供生长因子和激素 提供贴附因子和伸展因子 提供结合蛋白 提供必需脂肪酸和微量元素,无血清培养基 提高重复性 减少微生物污染 供应充足稳定 产品易纯化 避免血清因素对细胞的毒性 减少血清

18、中蛋白对生物测定的干扰,无血清培养基加入添加剂 生长因子和激素 结合蛋白 贴附因子和伸展因子 有利细胞生长的因子和元素,第五节 动物细胞培养方法和操作方式,一、动物细胞大规模培养的方法 依细胞种类: 原代培养 传代培养 依培养基: 液体培养 固体培养,依培养器和方式: 静止培养、旋转培养、 搅拌培养、微载体培养、 中空纤维培养、 固定床或流化床培养,从生产实际分为: 悬浮培养 贴壁培养 贴壁-悬浮培养,悬浮培养 让细胞自由的悬浮于培养基内生长繁殖。 适用于悬浮细胞和兼性贴壁细胞。 优点：操作简便，培养条件均一，传至和传氧好， 容易扩大培养规模，可借鉴细菌发酵的经验。 缺点：体积小，较难采用灌流

19、培养。 常用反应器为搅拌和气升式。,贴壁培养 让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法。 优点：适用的细胞种类多，较容易采用灌流培养，达到高密度细胞。 缺点：操作比较复杂，需要合适的贴附材料和足够的面积，培养条件不易均一，传质和传氧较差。,贴壁-悬浮培养（假悬浮培养） 微载体培养 葡聚糖类、聚苯乙烯类、胶原类 优点：可创造相当大的贴附面积，载体体积较小，比重较轻，在轻度搅拌下即可携带细胞自由地悬浮在培养基内，发挥悬浮培养的特长。, 包埋和微囊培养 细胞被包埋在凝胶载体或微囊内 优点：包埋或包裹在凝胶载体和微曩内的细胞可获得保护，避免了剪切力的损害；可以获得较高的细胞密度；通过控制微曩膜的孔径可

20、使产品浓缩在微曩内有利于下游处理；可采用多种生物反应器进行大规模培养, 结团培养 用细胞本身作为基质，相互贴附后，再用悬浮的方法培养 优点：操作简单、节省微载体用量。,二、动物细胞培养的操作方式,分批式培养 分批式培养是指先将细胞和培养液一次性装入反应器内进行培养，细胞不断生长，同时产物也不断形成，经过一段时间的培养后，终止培养。,2、流加式培养 先将一定量的培养液装入反应器，在适宜的条件下接种细胞，进行培养，使细胞不断生长，产物不断形成，而在此过程中随着营养物质的不断消耗，不断地向系统中补充新的营养成分，使细胞进一步生长代谢，直到整个培养结束后取出产物。,3、半连续式培养 半连续式培养又可称

21、为反复分批式培养，是指在分批式培养的基础上，将分批培养的培养液部分取出，并重新补充加入等量的新鲜培养基，从而使反应器内培养液的总体积保持不变的培养方式。,4、连续式培养 连续式培养是指将细胞种子和培养液一起加入反应器内进行培养，一方面新鲜的培养液不断加入反应器内，另一方面又将反应器液连续不断地取出，使反应条件处于一种恒定状态。,5、灌流式操作 当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时不断的补充新鲜培养基。 与连续式培养不同：过程中不取出细胞，细胞仍留在反应器内，使细胞处于一种营养不断的状态。,通过调节灌注速度，可以把培养过程保持在稳定的、废代

22、谢物低于抑制水平的状态下。,表 不同培养方式对CHO细胞生产人组织血纤维溶酶原激活剂（tPA)产量和活性的影响,第六节 动物细胞生物反应器及其检测控制系统,一、动物细胞生物反应器的类型及其基本结构 搅拌式生物反应器 气升式生物反应器 中空纤维式生物反应器 透析袋或膜式生物反应器 固定床或流化床式生物反应器,搅拌式生物反应器,适用悬浮细胞培养、微载体培养、微囊培养及结团培养。,气升式生物反应器,主要用于悬浮细胞的分批培养,与搅拌式生长反应器相比，气升式生物反应器产生的湍流温和而均匀，剪切力相当小，反应器内没有机械运动部件，因而细胞损伤率比较低；同时由于采用直接喷射空气供氧，氧传递速率高；液体循环

23、量大，能使细胞和营养成分均匀地分布于培养基中。 在气升式生物反应器中，溶氧的控制可以通过自动调节进入空气的速率来实现；PH值可通过在进气中加入二氧化碳或加入氢氧化钠来控制。,气体混合物从底部的喷射管进入反应器的中央导流管使得中央导流管侧的液体密度低于外部区域从而形成循环。 内循环和外循环,中空纤维式生物反应器,优点：占地小；产品产量、质量高；成本低。 缺点：不能重复使用；不能耐高压蒸汽灭菌；难以取样检测。 既适用贴壁细胞培养，也适用悬浮细胞培养。细胞的密度最高可达109/ml数量级。中空纤维管生物反应器已进入工业生产，主要用于培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体。,平床式中空纤维式生物反应器,透析袋或

24、膜式生物反应器,既可培养贴壁细胞，也可培养悬浮细胞。 优点：使细胞达到很高密度；操作可随意组合；分离提纯。,固定床或流化床式生物反应器,多级流化床式生物反应器专用于比重较大的多孔微球的培养。,培养液通过反应器垂直向上循环流动不断提供给细胞必要的营养成分，使细胞得以在微粒中生长；同时，不断地加入新鲜的培养液，并不断地排除培养产物或代谢产物。 循环系统中采用膜气体交换器，能快速提供给高密度细胞所需的氧。,CellGen plus生物反应器,通气搅拌与固定床结合 既可培养贴壁细胞又可培养悬浮细胞。,二、动物细胞生物反应器的检测控制系统, 培养过程需检测的物化参数 直接在线检出 取样离线检测 检测后计

25、算 主要参数的检测和控制方法,主要参数的检测和控制方法, 温度：电阻温度计 pH：复合式参比电极 在培养初期，控制进入培养基的CO2量 当细胞密度提高后控制NaHCO3的量,溶氧 改变进气的组成 加大通气流量 适当提高转速 采用在反应器外通气 搅拌 ：100r/min 进出液流量 其它：罐压、液位等。,迄今为止，已有大约300种重组蛋白药物正在进行临床试验，但,在哺乳动物工程细胞中大规模生产的只有少数几种：,b 干扰素g 干扰素,凝血因子VIII凝血因子IX,促红细胞生成素（EPO）生长因子（hGH）,白介素 2（IL-2）乙型肝炎表面抗原,单克隆抗体 CD4受体,组织型纤溶酶原激活剂（tPA

26、）,第七节 动物细胞产品制造实例,一、类淋巴细胞干扰素 Na-IFN-：利用从Burkitt淋巴瘤的患者获取的Namalva细胞生产。 首先由英国的Wellcome公司Fante和Finter等开发成功，扩大至8000L罐生产。 1986年在英国批准进入市场，商品名“Wellferon”，后被日本引进，商品名为“Sumiferon”,培养基：RPMI1640，10%小牛血清 培养方式：搅拌式批次培养 纯化方法： （1）三氯乙酸沉析 超滤膜浓缩 凝胶过滤 单克隆抗体亲和层析 （2）单克隆抗体一步纯化法,二、组织纤溶酶原激活剂 第一个由重组哺乳动物细胞规模化生产的医用蛋白是治疗急性心肌梗塞的溶血栓

27、药物，由美国Genetich公司用CHO细胞表达，1987年批准上市。 第二代溶栓药(第一代溶栓药：链激酶，尿激酶）,一种丝氨酸蛋白酶，与纤溶酶原亲和力低，而与纤维蛋白亲和力较大，后两者结合后形成的复合物可提高其与 tPA 的亲和力，使纤溶酶原活化为纤溶酶，后者可水解纤维蛋白，导致血栓溶解，故对血栓性疾病有较好疗效。 人黑色素瘤细胞株培养后可产生大量的 tPA，其培养液中 tPA 浓度可达到 1 毫克/升。,同样采用DHFR-MTX系统表达，受体细胞选用CHO系统。,此外，人tPA也可由重组大肠杆菌生产，但蛋白的重折叠效率低。,工艺过程 A、培养基：主要为 Eagle 培养基 B、tPA 抗体

28、制备：取人 tPA 或猪心 tPA 免疫家兔，按每只家兔 2000-300微克计，用福式完全佐剂充分乳化注入家兔皮下，每隔两周再用 100 微克 tPA 加强免疫，共加强两次。,C、抗 tPA 亲和吸附剂制备 D、细胞培养 E、tPA 的分离 F、精制,三、单链尿型纤溶酶原激活剂尿激酶原,第二代溶栓药 表达系统 德国：大肠杆菌 Saruplase 美国：骨髓瘤细胞 Prolyse 中国：南京大学：大肠杆菌 军事医学科学院生物工程研究所： CHO细胞,10月29日，上海天士力国家一类生物新药普佑克成果发布上市启动仪式,上海天士力药业的技术人员在细胞大规模培养间进行哺乳动物细胞的培养,四、乙型肝炎

29、疫苗,疫苗分类 按疫苗的材料可分为： 细菌性疫苗：霍乱疫苗、伤寒疫苗、卡介苗 病毒性疫苗：狂犬疫苗、脊髓灰质炎疫苗等 类毒素：白喉内毒素、破伤风内毒素等 按疫苗的性质可以划分为：灭活疫苗、减毒活疫苗,人类使用各种疫苗的时间表,小蛋白：S蛋白 中蛋白：preS1蛋白 大蛋白：preS2蛋白,第一代乙肝疫苗：血源疫苗 现在已上市的乙肝疫苗有史克必成公司的Engerix-B、默克公司的Recombivax等产品。Biogen公司与英国的Edinburgh大学共同研发酵母菌制造乙肝疫苗技术，并授权史克必成公司销售其产品，商品名为EngerixB。,我国生产的基因乙肝疫苗有两种 : 一种是从默克公司引进

30、的酵母基因工程乙肝疫苗，又北京天坛生物和深圳康泰公司生产。 另一种是1991年中国预防医学科学院病毒学研究所联合长春生物技术研究所等单位研制成功哺乳动物（CHO）细胞表达的基因工程疫苗，已有长春生物技术研究所、华北制药集团、北京华尔盾公司、兰州生物技术研究所、武汉生物技术研究所和成都生物技术研究所获得生产批文。,微载体篮式生物反应器灌流培养 14000r/min离心 疏水层析 阴离子交换层析 凝胶过滤,第八节 动物细胞制药的前景与展望,一、提高产量降低成本和改进质量方面的研究 二、转基因动物的研究 三、组织工程的研究,一、提高产量、降低成本和改进质量方面的研究,提高产量即提高细胞表达的水平，选用合适的载体和表达方式。 降低成本需要改进培养基配方，尽可能采用廉价原料，同时还应从改变细胞代谢途径着手。 改进质量主要是糖基化质量问题，选用合适宿主、改变细胞的某些酶基因、改进控制培养条件使产物正确糖基化。,把外源性目的基因，注射到受精卵的细胞核中，使注射的DNA整合到受精卵的基因组中。然后将该卵细胞注射（