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1、第5章 RNA的分离纯化,5.1 RNA的分离纯化原理 5.2 特殊类型的RNA的分离纯化,本章主要内容,5.1 总RNA的分离纯化原理,一个典型的哺乳动物细胞中含有约10-5 gRNA，其中80一85是rRNA，1015为tRNA，mRNA占1 5，其他的各类RNA不到1。,这些高丰度的rRNA和tRNA的大小和序列确定，可通过凝胶电泳、密度梯度离心、阴离子交换层析和高压液相层析(HPLC)等进行。,而不同的mRNA之间在大小和序列方面相差很大，长度从几百碱基到几千碱基不等。但大多数真核mRNA 3端带有足够长的多聚腺苷酸残基，使其可通过与挂有oligod(T)的纤维素亲和而纯化。,与DNA

2、的提取类似，RNA的提取一般也要经过细胞组织破碎，除去蛋白质和DNA以及其他杂质，最后得到RNA。,需要注意的是由于分解RNA的RNA酶活性很强而且分布极为广泛，以及RNA本身的不稳定性，所以需要特别注意防止RNA被降解。,在提取过程的第一阶段细胞的RNA酶应尽快灭活。一旦内源的RNA酶被破坏，RNA受损的可能就大大降低，而纯化的过程就可以按合适的速度进行。,RNA的提取方法一般有酚法，去污剂法和盐酸胍法等，这些方法都可以用来提取具有生物活性的RNA。,此外，工业上还常用稀碱法和浓盐法提取酵母RNA。用稀碱法和浓盐法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，工艺比较简单。,稀碱法

3、使用1NaOH使酵母细胞裂解，使核酸释放出来。然后用盐酸中和，除去菌体，水溶液中的RNA用酸调pH 2.5，即沉淀得RNA粗品。,浓盐法是在10NaCl溶液90提取34小时，然后提取液经离心后以乙醇沉淀RNA。,可以使RNase失活的一些试剂,硫氰酸胍、盐酸胍、异硫氰酸胍、亚硫氢胍、苯酚、巯基乙醇、n-月桂肌氨酸、氯仿、RNA酶的蛋白质抑制剂、氧钒核糖核苷复合物、硅藻土(Macaloid)等。,这些试剂有的是在细胞破碎之后就要加入的，但是有的是要在分离纯化的后期才加入的。,几种提取具有生物活性RNA的方法,(1)胍盐法,(2)去垢剂法,(3)苯酚法,(1)胍盐法,用盐酸胍提取分离RNA是20世

4、纪50年代提出的，早期由于各实验使用盐酸胍的浓度不同，所得到RNA分子量大小差别较大。,后来证明4M盐酸胍不仅可以使蛋白质变性而与核酸分离，而且还有效抑制RNase 。,但2M浓度的盐酸胍则不能很好抑制RNase，所得RNA分子量较低。但如使用其他抑制剂配合2M盐酸胍使用，则也可获得较高分子量的RNA。,盐酸胍法也可用于DNA的提取，但具体例子不多。总的来说，盐酸胍是提取分离RNA的一种方法，但不如酚法和去污剂法效果好，故应用不广。,硫氰酸胍,用硫氰酸胍提取RNA的方法是首先在1977年由Ullrich等提出，而在1978、1979年由Han和Chirgwin等正式发表的文章得到详述。,由于H

5、an的方法中要用连续少量的5 M硫氰酸胍溶解RNA，较为繁琐。而在Chirgwin的方法中，培养好的组织或细胞用4M硫氰酸胍溶解，将所得的匀浆铺在氯化铯浓溶液上。,由于RNA在氯化铯中的浮密度(1.8 g/ml)比其他细胞成分的浮力密度大得多，在超速离心过程中rRNA和mRNA将沉到管底。蛋白将保留在胍基盐裂解液中而DNA悬浮在氯化铯上层液体中。,由于Chirgwin的方法能够较易得到回收率和质量都很高的RNA，因此成为20世纪80年代早期提取高相对分子质量RNA的常规方法。,然而该方法有一个缺陷，即不适合从很多不同的培养细胞中分离RNA。为此后来发展出一步法。,在一步法中，硫氰酸胍用酚、氯仿

6、抽提。该方法不需要超速离心，因而可使许多样品同时进行操作并且提高速度、降低成本，而且在得到最后产物或纯RNA的过程中不会有浪费。,有两种情况是一步法所不适用的。一种情况是该方法不适合从含有丰富甘油三酯的脂肪组织中提取RNA。,另一种情况是提取RNA的胍基盐被细胞内的多糖和蛋白多糖所不同程度的污染。,有报道说这种污染阻止了乙醇共沉淀后RNA的溶解，影响RT-PCR的结果，而且在RNA印迹过程中与膜结合。所以，如果出现了多糖和蛋白多糖污染的问题，应该使用其他的方法和改变RNA沉淀条件。,(2)去垢剂法,去垢剂不仅广泛应用于DNA的提取，也普遍应用于提取各种RNA。其中使用最多的是十二烷基硫酸钠(S

7、DS)，使用浓度为0.52，单独使用此法提取动物组织的RNA和植物病毒的RNA曾取得一定成功，但不能将蛋白质完全除去。,近年来多与酚法、氯仿法、超离心法结合提取不同材料的tRNA、rRNA、mRNA获得十分良好的效果。其中尤以去污剂/苯酚法最受欢迎。,(3)苯酚法,苯酚法用于提纯RNA先于DNA，现仍是分离提取RNA最好的方法，此法可以单独使用或与其他方法结合使用，广泛用于各种RNA的提取。根据其使用条件及与其他方法结合情况可分为冷酚法、热酚法，皂土-酚法、去垢剂-酚法等。,热酚法多用于植物组织及病毒RNA的提取，主要由于这些材料细胞壁及外壳比较坚硬，脂质较多，必须升高酚的提取温度，才能使RN

8、A释放出来。,皂土-酚法和去垢剂-酚法，有利于抑制RNase的作用及解离蛋白质与核酸的结合，使蛋白质变性而除去。,各种方法的综合使用是目前提取核酸最常用和最有效手段，其原理通常是相互取长补短，以便获得更纯更完整的核酸分子，满足分子生物学对核酸分子结构和功能方面研究越来越高的要求。由于RNA酚法提取的应用十分广泛，资料甚多。,Invitrogen公司的一步法总RNA提取试剂TRIZOL比其他纯化方法可提高产率30%-150%。这种酚和异硫氰酸胍的混合溶液可直接用于从人类、动物、植物、细菌等的细胞或组织中提取总RNA、DNA或蛋白质。,在匀浆或裂解样本过程中，TRIzol试剂不仅可裂解细胞，而且可

9、保持RNA的完整性。加入氯仿后离心，溶液则分为水相和有机相，RNA绝大部分保留于水相，RNA转到水相后，用异丙醇沉淀以获得RNA，移去水相后，样本中的DNA和蛋白质可用连续沉淀获得。,用乙醇沉淀可在中间相获得DNA，用异丙醇沉淀可在有机相获得蛋白质。该技术适于在人、动物、植物、细菌少量组织(50-100mg)和细胞(5X105)以及大量组织(1g)和细胞(5X107)中分离RNA，效果很好，整个过程可在1h内完成。,用TRIzol试剂分离的总RNA没有蛋白质和DNA的污染，可用于Northern blot分析、斑点杂交、poly(A)选择、体外翻译、RNase保护分析、分子克隆等。TRIzol

10、试剂易于分离不同大小分子质量的各种RNA。,具体的操作步骤这里就不再讲述，感兴趣的同学可自己查阅。,5.2 特殊类型的RNA的分离纯化,(1) mRNA的提取,在构建cDNA文库等的时候必须使用mRNA，对得到的总RNA要进行再纯化。细胞内总RNA制备方法很多,一般是得到高质量的总RNA后再分离得到纯的mRNA。,一般分离mRNA的原理是利用mRNA的3末端含有poly(A)+ 的特点,当RNA流经oligo (dT)纤维素柱时,在高盐缓冲液作用下, mRNA被特异吸附在oligo(dT)纤维素上,然后逐渐降低盐浓度洗脱,在低盐溶液或蒸馏水中,mRNA被洗下。,一般经过两次oligo(dT)纤

11、维素柱，即可得到较纯的mRNA。纯化的mRNA在70%乙醇中-70可保存一年以上。,oligo(dT)纤维素柱用后可用0.3mol/L NaOH洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入0.02%叠氮钠冰箱保存，重复使用。,另外一种提取mRNA的方法,生物素化oligo(dT)-链亲和素磁珠纯化带poly(A)RNA,本方法的原理与前一种方法相同，但用磁性微球代替纤维素作为介质。这种方法比较常用且已商品化。,RNA提取过程中，最应注意的是：组织或细胞在变性液中完全裂解的同时，如何抑制RNase引起的RNA降解问题。在直接加工新鲜组织时，所有的细胞能尽可能快的接触变性剂以完全裂解这一步是相当重要的

12、。,不同处理组织的方法对提取RNA产量的影响,一些难以加工的组织，例如：坚硬的肿瘤、细菌细胞、植物根部等，即使使用匀浆器一般也不能很有效的裂解。此时，通常可以在处理组织时，先对其进行冷冻处理，以使之充分裂解。,为使迅速冷冻样品，以使整块组织彻底冷冻，因此，在冷冻前应先将组织切成小块，然后将其浸没于液氮中。这将会使组织块以最快的方式冷冻。另外，也可将一个金属盘置于干冰上作为冷冻的表面，以对片状的组织进行快速的冷冻。,例如，使用三种方法分别描述了用三种不同的方式加工0.1g冷冻的小鼠肝脏组织，以产生组织/细胞裂解产物。裂解产物可进行RNA的提取纯化，或用于估计poly(A)+RNA 的产量。,虽然

13、这三种方法同是利用胍缓冲液以彻底裂解细胞，但是它们在先前的步骤中，即如何加工组织或是在如何裂解的过程中有所不同。,方法一：在匀浆器中加工冷冻的组织。 方法二：通过注射器加工冷冻的组织。 方法三：在液氮中将组织研磨成粉末。,将冷冻的样品放在研钵中进行剧烈研磨以使其粉碎。当组织被磨成粉状后，向研钵中加入变性缓冲液，并搅拌均匀。混合物融化后应转移到合适的容器中进行进一步的操作。在液氮中研磨组织至粉末状，细胞的裂解则更完全，因此能得到比前两种方法多近一倍的产量。,可见，即使对于同一种组织，采用同一种试剂进行RNA的提取，仅仅由于组织样品处理方法的不同，就导致了RNA提取量的显著差异。,因此，在对不同的

14、组织进行RNA提取时，不仅要选择最合适的提取方法，同时也要根据所处理的组织，以及提取目的以选择最为合适的组织处理方法，只有这样才能获得最佳效果。,(2) 其他种类的RNA由于一般实验室中使用的较少，这里不再讲述。,5.3 如何抑制RNA酶的活性,由于核糖在2和3位带有-OH，所以RNA比DNA易于被RNA酶降解。而RNA酶存在于裂解的细胞中,以及皮肤上等，故要小心防止玻璃器皿、操作平台以及浮尘中RNA酶的污染。,目前尚无使RNA酶失活的简易办法。链内二硫键的存在使RNA酶可抵抗长时间煮沸和温和变性剂，变性的RNA酶可迅速重新折叠。,和DNA酶不同，RNA酶不需要二价阳离子激活,因此难以被缓冲溶

15、液中加入的EDTA或其他金属离子螯和剂失活。防止RNA酶最好的办法就是在第一步即避免污染。,实验中的RNA酶的来源有2种，即内源性和外源性的，对于外源性的RNA酶的活性，我们一般要注意以下个方面：,(1) 玻璃制品、塑料制品和电泳槽,a 灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNA酶，可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA。,b 实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有RNA酶污染，使用前必须于180 干烤小时或更长时间（玻璃器皿）或用氯仿冲洗（塑料制品）。,另一方法是用0.1 焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡用于RNA的烧杯、试管和其他用品。DEPC是RNA酶的强烈抑制剂。,灌满DEPC的玻璃

16、或塑料器皿在37放置小时，然后用灭菌水淋洗数次。然后高压蒸汽灭菌15分钟，可以除去器皿上剩余的DEPC，以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。因为羧甲基化的RNA的翻译效率很低。,c 尽量使用一次性枪头、离心管等塑料制品，尽量避免与其它实验共享器具，以防止交叉污染。推荐使用出厂前已经灭菌的枪头和离心管。,有多家厂商供应的无菌塑料制品无RNA酶污染，可直接用于RNA操作。许多研究者用DEPC等处理的塑料制品，往往由于二次污染而带有RNA酶，从而导致实验失败。,d 用于RNA电泳的电泳槽应用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满3的H2O2溶液，室温放置10分钟，然后用0

17、.1 DEPC处理过的水彻底冲洗电泳槽。最好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和电泳槽作上特殊标记，存放在指定地点，为RNA实验专用。,(2)研究人员造成的污染,RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此，在准备分离的和分析RNA的材料和溶液时，涉及RNA的一切操作过程中，都应戴一次性手套，但接触过其他物品以后手套就可能沾染上RNA酶,因此进行RNA实验时应勤换手套。,尽量避免使用一次性塑料手套，塑料手套不贴身，常常造成操作不便，而且多出部分还容易在器具上遭RNA酶污染并向未污染处传递，扩大污染。,对橡胶手套可以防止RNA酶的问题的迷信已经在许多实验室扎根!事实上，仅仅抓住橡胶手套正如抓住兔子的

18、爪子一样不可靠。首先，研究者的头发与胡须较手更容易充当罪魁祸首。,更重要的是，手套只有在他们与接触皮肤的表面接触前能提供有效的保护!虽然这未必会有用，但必需在每次接触任何一小块仪器之后更换手套：开关冰箱、填充冰桶、填写实验记录、称量试剂!这既不聪明又不实用!带上手套，但不要相信它可以彻底对抗RNA酶!,(3)污染的溶液,用高压灭菌的水和RNA研究专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，将溶液装入无RNA酶的玻璃器皿。可能的话溶液均应用0.1DEPC于37至少处理12小时，然后于100加热15分钟或高压蒸气灭菌15分钟。,注意：DEPC可与胺类迅速发生化学反应，因些不能用来处理含有Tri

19、s 一类的缓冲液。可存几瓶新的未开封的Tris晶体以制备无RNA酶的溶液。,由于粗心的无菌操作，使缓冲液被细菌或其他的微生物污染。这些微生物的污染通常不能肉眼可见并且不必使缓冲液变色就足以导致问题!因为RNA酶不能通过高压灭菌而除去，被污染的溶液或怀疑可能污染的溶液必须丢弃!,(4) 如果可能，实验室应辟出专门RNA操作区，离心机、移液枪、试剂等均应专用。RNA操作区应保持清洁，并定期进行消毒。,自动移液装置：如果自动移液器以前被用来分配含有RNA酶溶液,例如准备 小量的质粒的过程或更加糟糕的是RNA酶保护实验，那么使用一次性没有RNA酶的移液器头已经没有任何意义。,如果移液器的枪管或金属枪栓

20、与试管的边缘接触，它就成了非常有效的散布RNA酶的载体。所以当处理RNA时要保证自动移液器专用。,(5) 配制溶液用的乙醇，异丙醇、Tris等应采用未开封的新品。溶液需用DEPC水配制。,分成小份保存溶液或缓冲液并在用后丢弃。不使用已经在实验室用于其他目的的材料或贮存液。,准备所有的溶液和缓冲液时，使用无RNA酶的玻璃器皿、DEPC处理过的水，用于RNA的化学用品用一次性刮刀或直接敲击瓶底分离。,用声誉好的厂家证明无RNA酶的一次性移液器头和微量离心管。为了减少污 染的机会，当从原包装取出这些小的器具放到实验室架子上时最好用无菌的镊子!,对于内源性的RNA酶，要注意以下几点：,(1) 样品采集

21、到之后，必须立即冷冻，防止内源RNA酶对RNA的降解。,样本一旦从生物体中分离后，细胞内的RNA就变得非常不稳定，容易降解。因此取样后，如何保证取样前后基因的表达模式不变，就变得非常重要。,传统方法是用液氮速冻，再放到超低温冰箱中保存。目前有些厂家开发出专门的RNA保护剂，如Qiagen公司的RNAlater是具有抑制RNase和稳定RNA作用的试剂。,将采集的组织样本等直接放入到RNAlater中，即可起到稳定样本中RNA的作用。无需液氮或干冰，方便安全地在室温下保存一段时间，低温可长期保存。,还有对细菌样本专用的RNAprotect Bacteria Reagent及对血液样本专用的PAX

22、gene Blood RNA System。,(2) 在提取过程中使用RNA酶的抑制剂活失活剂，如在缓冲液中加入去垢剂、硫氰酸胍以及在后续的提取过程中使用苯酚、氯仿等变性剂。,(3) 得到RNA样品后采用正确的方法储存。,(4) 设计好试验步骤，尽可能的连续进行。,2 几种广泛应用的特异性RNA酶抑制剂,是从人胎盘分离的一种蛋白质,可与多种RNA酶紧密结合形成非共价结合的等摩尔复合物，使RNA酶失活。此蛋白质体内可能是血管生成素的抑制剂，血管生成素是氨基酸序列和推测的三级结构与胰RNA酶类似的一种血管生成因子。,(1) RNA酶的蛋白质抑制剂,几个厂家以不同的商品名出售这种抑制剂，该蛋白质应置

23、于含5mmol/L二硫苏糖醇的50甘油中，贮存于-20。抑制剂制品冻融数次后或放置在氧化条件下即应弃之不用，因为上述处理会使蛋白质变性从而释放出所结合的RNA酶。,因此，在使用变性剂裂解哺乳动物细胞这一提取RNA的初始步聚中不应使用这种蛋白抑制剂。然而使用更温和的裂解方法时应使用这种抑制剂，并且在后续的所有RNA纯化步骤中均应有此蛋白质存在。,由于酚抽提可以除蛋白质抑制剂，故应在纯化过程中补加几次抑制剂。其最大活性的发挥要求巯基试剂，而且它并不干扰反转录或mRNA在无细胞体系中的翻译。,不同厂家出售的不同来源的RNA酶蛋白抑制剂有不同的商业名称(如RNAsin；Prime Inhibitor，

24、5Prime3 Prime)。尽管这些多样的产品需要多样的巯基化试剂，它们都具有广谱的RNA酶抑制活性却不抑制其他的核酶或多聚酶或体外翻译系统。,（2）焦碳酸二乙酯(DEPC),一种高活性的烷化剂，用来灭活缓冲液和玻璃器皿中的RNA酶。因为DEPC不加选择的修饰蛋白质和RNA，因此在分离和纯化RNA过程中不能使用，而且它与一些缓冲液(例如Tris)不能相容。,DEPC在分子克隆中被用来灭活痕量RNase，它可能污染用来制备rRNA、mRNA的溶液、玻璃制品和塑料制品。DEPC是高度活性的烷基化试剂，通过组胺基团的乙氧基甲酸化形式破坏RNase的酶活。,玻璃制品和塑料制品应该浸泡在0.1的DEP

25、C水溶液中，371 h，或室温下过夜。用DEPC处理的水淋洗数次，随后高压蒸汽灭菌15min。,在水溶液中，DEPC迅速水解为CO2和乙醇，在pH6.0 的磷酸缓冲液中半衰期为20min，在pH7.0的磷酸缓冲液中为10min。,这种水解过程通过Tris和其他胺类大大加速，他们自己本身也在这一过程中消耗了。因此，DEPC不能用来处理含有这些缓冲液的溶液。,无亲核体(例如：水和乙醇)的DEPC样品是非常稳定的，但是甚至小量的上述溶质也能导致DEPC完全转化成碳酸二乙酯。由于这个原因, DEPC应该防潮，并小份储存于干燥的条件下。在开启瓶子前，应使瓶子达到足够的温度。,尽管通过性能良好的、现代化的

26、可逆渗透系统纯化的水不含有RNA酶，维护较差的纯化系统很可能导致微生物的污染。这种情况多发生在配备有许多灌注和存储仪器的巨型中心系统中，水会在其中停滞。在这种条件下，通过应用0.1DEPC在37 处理1h制备DEPC处理的水，并高压灭菌。,(3) 氧钒核糖核苷复合物,这种由氧钒离子和4种核糖核苷之中的任意一种所形成的复合物，是一种过渡态类似物，它能与多种RNA酶结合并几乎能百分之百地抑制RNA酶的活性。这种氧钒核糖核苷复合物可加入完整细胞中，在RNA提取和纯化的所有过程中，其使用浓度是10 mmol/L。,所得到的mRNA可直接在蛙卵母细胞中进行翻译，并能作为某些外酶促反应（如mRNA反转录）

27、的模板。然而氧钒核糖核苷复合物强烈抑制mRNA在无细胞体系中的翻译，因此必须用含0.1 羟基喹啉的苯酚pH7.8多次抽提以除之。,(4) Macaloid（硅藻土）,Macaloid是一种粘土，很多年前就发现它能吸附RNA酶，用缓冲液将其制成浆液，以0.015（W/V）的终浓度溶解细胞。 这种粘土随同它所吸附的RNA酶可在后续的RNA纯化过程中（如酚抽提后）经离心去除。,(5) 胍盐,胍盐是破坏蛋白质三维结构的离液剂。在通常使用的蛋白质变性剂中作用最强的是异硫氰酸胍和盐酸胍，他们可以使多数蛋白质转换成一随机的卷曲状态，但机制不清。在RNA分离过程中，首先作为蛋白变性剂的的胍盐是盐酸胍。,尽管盐

28、酸胍是一个核酸酶的强抑制剂，但却是一个作用不够强的变性剂，但也可用于从富含RNase的组织中提取完整的RNA。,另一种较强的离液剂异硫氰酸胍含有强力的阴离子和阳离子基团，他们可以形成较强的氢键。在还原剂存在的情况下，异硫氰酸胍可以撕裂氢键，在有去污剂如十二烷基肌氨酸钠存在的情况下可以破坏疏水作用。,3 多糖的影响,多糖的污染是提取植物RNA时常遇到的另一个棘手的问题。植物组织中往往富含多糖，而多糖的许多理化性质与RNA很相似，因此很难将它们分开。,在去除多糖的同时RNA也被裹携走了，造成RNA产量的减少；而在沉淀RNA时，也产生多糖的凝胶状沉淀，这种含有多糖的RNA沉淀难溶于水，或溶解后产生粘

29、稠状的溶液。,由于多糖可以抑制许多酶的活性，因此污染了多糖的RNA样品无法用于进一步的分子生物学研究。,在常规的方法中，(1)通过SDS-盐酸胍处理可以部分去除一些多糖；(2)在高浓度Na+或K+离子存在条件下，通过苯酚、氯仿抽提可以除去一些多糖；,(3)通过LiCl沉淀RNA也可以将部分多糖留在上清液中。但即使通过这些步骤仍会发现有相当多的多糖与RNA混杂在一起。,用低浓度乙醇沉淀多糖是一个去除多糖效果较好的方法。在RNA提取液或溶液中缓慢加入无水乙醇至终浓度1030，可使多糖沉淀下来，而RNA仍保留于溶液中。一般都是在植物材料的匀浆液中加入乙醇，,另一个常用的方法是醋酸钾沉淀多糖法。如在提

30、取云杉组织的RNA时，可在匀浆上清液中加入1/3体积的5M醋酸钾（pH4.8）溶液以沉淀多糖。,也有人认为缓冲液中含有高浓度的NaCl有助于去除多糖。,植物组织中除去多糖是一项重要的工作，这方面有许多文献可供参考。,4 酚类化合物的干扰及对策,许多植物组织特别是植物的果实（如苹果、樱桃、李子、葡萄等）和树木类植物中富含酚类化合物。酚类物质的含量会随着植物的生长而增加。因而从幼嫩的植物材料中更容易提取RNA。此外，针叶类植物的针叶中多酚的含量比在落叶植物的叶子中要高得多。,在植物材料匀浆时，酚类物质会释放出来，氧化后使匀浆液变为褐色，并随氧化程度的增加而加深，这一现象被称为褐化效应。被氧化的酚类

31、化合物（如醌类）能与RNA稳定地结合，从而影响RNA的分离纯化。,但Newbury等发现RNA提取的难易程度与材料中酚类物质的总量之间并无相关性，因此认为不是所有的酚类化合物都影响RNA的提取。,但一般认为所谓的“缩合鞣质”即聚合多羟基黄酮醇类物质（如原花色素类物质）是影响RNA提取的一类化合物。目前去除酚类化合物的一般途径是在提取的初始阶段防止其被氧化，然后再将其与RNA分开。,还原剂法：一般在提取缓冲液中加入(- 巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）或半胱氨酸来防止酚类物质被氧化，有时提取液中-巯基乙醇的浓度可高达2。 - 巯基乙醇等还可以打断多酚氧化酶的二硫键而使之失活。有人认为在过夜沉淀RNA时加入- 巯基乙醇（终浓度1）可以防止在此过程中酚类化合物的氧化。硼氢化钠（NaBH4）是一种可还原