土壤中分解尿素的细菌的分离与计数-上课用

1、课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,一、课题背景,1、尿素的利用,尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、细菌利用尿素的原因,土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶,3、常见的分解尿素的微生物,芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌。,4、课题目的,从土壤中分离出能够分解尿素的细菌,统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌 (计数),一.研究思路,.筛选菌株,.统计菌落数目,.设置对照,1、实例：,启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的 要求，到相应的环境中去寻找。,原因：因为热

2、泉温度70800C，淘汰了绝大多 数微生物只有Taq细菌被筛选出来。,DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。,.筛选菌株,总之：要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等；配置合适的培养基 方法： 抑制大多数微生物生长 造成有利于该菌生长的环境， 结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过 稀释涂布平板法等方法对它进行纯化培养分离。,2、实验室中微生物的筛选原理：,人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。,3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培

3、养基：,从物理性质看此培养基属于哪类？ 从功能上属于哪类培养基？,固体培养基,在此培养基中哪些作为碳源、氮源？,碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素,选择培养基,尿素是培养基中的唯一氮源， 只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源，才能生长。 缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。,5、该培养基选择分解尿素的微生物的原理,选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。,6、怎样证明此培养基具有选择性呢？,以尿素为 唯一氮源 的培养基,牛肉膏 蛋白胨 培养基,是,

4、分离能分解尿素的 细菌,判断该 培养基 有无选 择性,只生长能分解尿素的细菌,生长多种微生物,是,栏目链接,用来判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置的对照是( ) A未接种的选择培养基 B未接种的牛肉膏蛋白胨培养基 C接种了的牛肉膏蛋白胨培养基 D接种了的选择培养基,C,1、显微镜直接计数：,利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,.统计菌落数目：,不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；,缺点,2.间接计数法（活菌计数法） 原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而

5、成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。 常用方法：稀释涂布平板法。,每克样品中的菌落数(CV)M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。,如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？,统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按课本旁栏的公式进行计算,教材P22,实例分析P22,第一同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。 第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了三个平板，但是其中1个平板的计数结果与2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将

6、3个平板的计数值用来求平均值。,注意事项 为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板上进行计数。 为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。(即设置重复组求平均数) 统计的菌落往往比活菌的实际数目低。,微生物的计数法,显微镜直接计数、 间接计数法（活菌计数法）、 比浊法、 滤膜法,设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。,.设置对照：,设置对照的方法：,空白对照：不给对照组任何处理因素。,条件对照（标准对照）：指給予对照组一种被证明有效因素的处理,自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行。,

7、相互对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。,课P23实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。,原因: (1)培养基被杂菌污染或操作失误 (或者是混入了其他的含氮物质) (2)土壤不同,小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。,方案二：由其他同学用与A同学相同土样进行实验,方案一：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果

8、不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,将细菌放在固体培养基上培养，它会繁殖并形成菌落(如下图)。某实验小组想检验两种抗生素的杀菌作用，下列哪个实验方案最合适(),C,菌落计数,系列稀释,涂布平板与培养,配制土壤溶液,根据图示27填写以下实验流程：,实验设计：,（一）土壤取样,（二）制备培养基,（三）土壤样品的稀释,（四）取样涂布,（五）微生物的培养与观察,（八）鉴定,（七）细菌的计数,二.实验的操作流程,二.实验的具体操作 .土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。 取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。,（

9、二）制备培养基： 制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。 牛肉膏蛋白胨培养基（作对照）,应在火焰旁称取土壤10g。 在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行,分离不同的微生物采用不同的稀释度,三土壤样品的稀释,分离不同的微生物采用不同的稀释度,原因：不同微生物在土壤中含量不同,由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103107。,由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103107。每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基，因此共需要15个选择培养基，5个牛肉膏蛋白胨培养基。此外，还需要准备8个灭菌的

10、试管和1个灭菌的移液管。,为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？,原因：土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。 结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。,（四）取样涂布,实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。,如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的

11、计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。,每个稀释度下需要3个选择培养基（作重复组）， 1个牛肉膏蛋白胨培养基（作对照）,.微生物的培养与观察,在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。,培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌：3037培养12d 放线菌：2528培养57d 霉菌：2528的温度下培养34d。,微生物的培养与观察,同种微生物有稳定的菌落特征：形状，大小，隆起程度，颜色,（六）鉴定：筛选后必鉴定 鉴别培养基：加入某种指示剂或化学药品，不影响微生物的生存 1、酚红

12、培养基：鉴定分解尿素的细菌。 原理：脲酶催化尿素分解成氨培养基碱性增强 酚红变红脲酶阳性 2、伊红美蓝培养基：鉴定大肠杆菌 原理：代谢产物与伊红美蓝结合 菌落呈黑色并带有金属光泽。,属鉴别培养基，它并没有促进大肠杆菌的生长和抑制其他微生物的生长,伊红美蓝培养基是鉴别培养基，可以用来检测自来水中的大肠杆菌是否超标，因为的代谢产物与伊红美蓝结合，使菌落呈深紫色并带有金属光泽，使大肠杆菌的菌落显示出来，并没有促进大肠杆菌的生长和抑制其他微生物的生长。,例如：鉴别大肠杆菌培养基,大肠杆菌呈黑色中心 ,有或无金属光泽,大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征,三、操作提示,无菌操作,做好标记,规划时间

13、,（一）培养物(即培养的目的菌种)中是否有杂菌污染? 以及选择培养基是否筛选出菌落?,对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。 牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。,四.结果分析与评价,如果学生选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。如果结果相差太远，需要进一步分析产生差异的原因。,（二）样品的稀释操作是否成功,如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。,（三）重复组的结果是否一致,接种,不接种,接种,接种,需将未接种的选择培养基同时进行培养,需设立牛肉膏蛋白胨培养

14、基进行接种后培养，观察两种培养基上菌落数目、进行对比得出结,实验设计原则 (1)设立重复组： 统计某一稀释度下平板上的菌落数时，要至少涂布三个平板作重复组，增强实验结果的说服力与准确性。 (2)设立两种对照组：,栏目链接,四.结果分析与评价,2,2,本课题知识小结:,课后练习,2.提示：反刍动物的瘤胃中含有大量的微生物，其中也包括分解尿素的微生物。 由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基外，还应参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。,11某化工厂的污水池中，含有一种有害的、难以降解的有机化合物A。研究人员用化合物A、磷酸盐、镁盐以及微量

15、元素配制的培养基，成功地筛选到了能高效降解化合物A的细菌(“目的菌”)。请分析回答下列问题。 (1)培养基中加入化合物A的目的是筛选_，这种培养基属于_培养基。 (2)“目的菌”生长所需的氮源和碳源是来自培养基中的_，实验需要振荡培养，由此推测“目的菌”的代谢类型是_。 (3)培养若干天后，应选择培养瓶中化合物A含量_的培养液，接入新的培养液中连续培养，使“目的菌”的数量_。 (4)可采用_的方法将“目的菌”接种到固体培养基上，通过_ 法对“目的菌”的数量进行统计，通常需要对菌落数为_的平板进行计数。 (5)实验结束时，使用过的培养基应该进行_处理后，才能倒掉。,“目的菌”,选择,化合物A,异

16、养需氧型,减少,增加,稀释涂布平板,活菌计数,30300,灭菌,1.使用选择培养基的目的是（ ） A.培养细菌 B.培养真菌 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别 2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是( ) A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3 C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素,实践训练,C,D,3.下列说法不正确的是（ ） A.科学家从7080度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶 B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值 C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验

17、结果的影响，提高实验结果的可信度 D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。 4.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（） A.较多的氮源物质 B.较多的碳源物质 C.青霉素类药物 D.高浓度食盐,B,C,（09，宁夏，15分） （1）在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑_、_和渗透压等条件。由于该细菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、_、_等优点，因此常作为遗传学研究的实验材料。 （2）在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行_（消毒、灭菌）；操作者的双手需要进行清洗和_；静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还能_。 （3）若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计值更接近实际值，除应