第九章-色谱分析法导论200101118

1、1,现 代 仪 器 分 析,2,现 代 仪 器 分 析 的四大波谱: 光谱法、核磁共振波谱法 、色谱法、 质 法、 光谱法: 利用光(电磁辐射)作为 “探针” 来探测物质性质、含量和结构的光学分析法. 核磁共振波谱法:利用磁性核在外磁场作用下,核自旋能及跃迁原理来研究有机物的结构与组成的一种化学物理分析法.,3,质谱法:是将待测样品在离子源中转化为离子,然后利用离子在电磁场中运动的性质,将离子按质荷比(m/e)分开,记录并分析离子按质荷比大小排列质谱图,通过对质谱图的解析进行定性,定量分析. 色谱法:利用样品中各组分在固定相与流动相中受到的作用力不同，而将待分析样品中的各组分依次分离，然后顺序

2、检测各组分含量的分离分析方法。,4,色谱法是一种分离技术,把这种分离技术应用到分析领域.并与适当的检测手段结合起来,就是色谱分析法. 由于色谱法的分离效率比常用分离方法(如重结晶、蒸馏、萃取等)高效.又有非常灵敏的检测手段.因此应用范围极其广泛,已成为生产、科研等各部门不可缺少的分离分析手段.,5,第一节 色谱法概述 第二节 色谱流出曲线(色谱图)及 有关参数 第三节 色谱理论 第四节 分离度及色谱分离方程 第五节 色谱定性、定量方法 qualitative and quantitative analysis in chromatograph,结束,第九章 色谱分析方法导论,6,色谱法也叫层析

3、法，它是一种高效能的物理化学分离技术，将它用于分析化学并配合适当的检测手段，就成为色谱分析法。,9.1 概述,7,Michael Tswett(1872-1919), a Russian botanist , discovered the basic principles of column chromatography. He separated plant pigments by eluting a mixture of the pigments on a column of calcium carbonate. The various pigments separated into co

4、lored bands; hence the name chromatography.,他为了分离植物色素，将植物绿叶的石油醚提取液倒入装有碳酸钙粉末的玻璃管中，并用石油醚自上而下淋洗，由于不同的色素在碳酸钙颗粒表面的吸附力不同，随着淋洗的进行，不同色素向下移动的速度不同，形成一圈圈不同颜色的色带，使各色素成分得到了分离。他将这种分离方法命名为色谱法（chromatography）。,8,色谱法的最早应用是用于分离植物色素，其方法是这样的：在一玻璃管中放入碳酸钙，将含有植物色素（植物叶的提取液）的石油醚倒入管中。,9,此时，玻璃管的上端立即出现几种颜色的混合谱带。然后用纯石油醚冲洗，随着石油醚

5、的加入，谱带不断地向下移动，并逐渐分开成几个不同颜色的谱带，继续冲洗就可分别接得各种颜色的色素，并可分别进行鉴定。色谱法也由此而得名。,10,现在的色谱法早已不局限于色素的分离，其方法也早已得到了极大的发展，但其分离的原理仍然是一样的。我们仍然叫它色谱分析。,11,一.色谱定义: 利用物质(样品)中组分在固定相与流动相中受到作用力不同,而将待测样品分离,然后顺序检测各组分含量的一种物理化学分析方法.,12,二 色谱法的发展历史,13,在色谱发展史上占有重要地位的英国人A.J. P. Martin(马丁)和R.L.M. Synge(辛格)，他们提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作

6、为流动相 （即气相色谱）。 1952年，因为他们对分配色谱理论的贡献获诺贝尔化学奖。,A.J. P. MARTIN. (1910-2002) of the British National Institute for Medical Research shared with fellow countryman R. L. M Synge the Nobel Prize in Chemistry (1952) for the invention of partition chromatography.,R.L.M. Synge born Oct. 28, 1914, Liverpool, Eng

7、.died Aug. 18, 1994, Norwich, Norfolk. Synge studied at Winchester College, Cambridge, and received his Ph.D. at Trinity College there in 1941.,MARTIN,Synge,14,: 由1906算起,色谱学已有近百年的历史.最初色谱学并未被人所重视. 三十年代新的色谱技术分相继产生,如薄层色谱、离子交换色谱. 在四十年代由发展了分配色谱、纸色谱以气-固形式的气相色谱.,15,五十年代初期气-液分配色谱的出现导致化学实验室技术上的一个史无前例的改革 (其中包

8、括离子交换色谱分析氨基酸和凝胶过滤色谱). 六十年代中期, 开始了液相色谱现代化的进程.六十年代末,液相色谱迅速地赶上气相色谱的发展,16, 七十年代,气相和液相同步发展. 八十年代液相色谱发展远远超过了气相色谱发展.高效液相色谱成为当前最受重视的色谱技术. 九十年代出现了毛细管电泳,使色谱分离更完善.,17,色谱学发展过程中的一些重要事件,按时间地顺序排列如下: 1903年 Tswett发表了吸附色谱分离植物色素的论文. 1906年 正式提出色谱法. 1938年 Izmailov和Shraiber第一次使用薄层色谱法.,18,1941 Martin和Synge用分配色谱分离氨基酸. 1944

9、 Martin和Synge发展了纸色谱成功分离氨基酸. 1952 Martin等人又提出了以气体为流动相的气相色谱.（气-液分配色谱） 1956 Van Deemter等发表关于色谱效率的速率理论,并应用到气相色谱中.,19,1957 制作离子交换色谱氨基酸分析仪. 1959 在Gordon Conference上提出了第一篇凝胶过滤色谱的报告. 1963 Giddings的理论工作为现代液相色谱奠定了理论基础. 60年代中期 凝胶渗透色谱出现. 60年代后期 亲合色谱出现.,20,1969年 高效液相色谱法迅速发展,使色谱成为一门应用广泛的分离分析方法.在现代分离分析技术中占有极重要的地位.

10、 80年代 现代液相色谱法迅速发展,很快超过气相色谱、层析色谱. 90年代 出现了毛细管电泳色谱.使色谱分离更加纯度大大提高.,21,三.应用概况 色谱法的应用范围相当广泛,除化学分析外,生物化学、石油化学、有机化学、无机化学、农业、生命、食品、轻工、医药学科中都普遍采用色普技术. 在现代所有的分析仪器中,没有一种象色谱仪这样在实际中得到如此迅速合广泛得应用.,22,药物分析: 人体代谢产物、营养成分、药物浓度、兴奋剂、巴比妥类安眠药. 自然界: 大气中一氧化碳分析、空气污染程度、苯系物、含硫化合物. 水中有机、卤化物、氯仿、四氯化碳、饮用水中有害物质.,23,食品工业: 食品中农药残留、有机

11、磷、有机氯、茶叶,加入WTO、108项指标检测. 大部分用色谱分析,氰戊菊脂、甲氰菊脂、优乐得. 欧盟指标.0.1mg/kg.标准下降100倍到几十倍1 ug/kg，现在已增加到276项。 蔬菜、水果、粮食、肉类、营养成分、有效成分、农残.,24,肯定列表：是日本针对食品中农业化学品残留管理而制定的一项新制度。 目标物：农药，食品添加剂和兽药。 2006年5月以前：242农药、30兽药 2006年5月以后：750项农药和兽药 检测指标10ppb,25,农业方面: 各种作物中营养成分分析,多糖、蛋白、脂肪酸、氨基酸.食用油中溶剂残留量得分析. 化学工业: 生产中从原料、半成品到成品成分分析.,2

12、6,畜牧业: 家禽、家畜、肉品质、不饱和脂肪 酸、蛋白质优劣(AA的配比). 鸡肉出口必检.克求酚(二氯二甲吡啶酚).,27,四.色谱的分类: 色谱有许多类型、从不同角度,有各种不同分类方法 1.按流动相状态分: 液相色谱 气相色谱 液相色谱: 流动相为液体的色谱. 气相色谱: 流动相为气体的色谱.,28,2、按固定相状态分: 气-固色谱: 流动相为气体,固定相为固 体的气相色谱. 气-液色谱: 流动相为气体,固定相为流 动的气相色谱. 液-固色谱: 流动相为液体,固定相 为固体 的液相色谱. 液-液色谱: 流动相为液体,固定相为液体的 液相色谱.,29,30,3 按固定相的形式分类可分为：

13、柱 色谱： 固定相装在色谱柱中； 纸色 谱： 利用滤纸作载体，吸附在纸 上的水作固定相； 薄层色谱：将固体吸附剂在玻璃板或塑 料板上制成薄层作固定相。,31,填充柱色谱 柱色谱 空心柱色谱（毛细管色谱） 色谱 纸色谱 平板色谱 薄层色谱,32,柱 色谱,33,4. 按分离机理分类 分配色谱 吸附色谱 色谱 离子交换色谱 凝胶色谱（排阻色谱） 电色谱 亲和色谱,34,吸附色谱: 利用组分在吸附剂上 的吸附能力 强弱不同而得以分离的方法。 分配色谱 : 利用组分在固定液（固定相） 溶解度不同而达到分离的方法。 离子交换色谱 : 利用组分在离子交换剂（固定 相）上的亲和力大小不同而 达 到分离的方法

14、。,35,凝胶色谱 利用大小不同的分子在多孔 固定相中的选择渗透而达到 分离，称排阻色谱法。 电 色 谱 利用带电物质在电场下移动速 度不同进行分离的色谱。 亲和色谱 利用不同组分与固定相（固定 化分子）的高专属性亲和力进 行分离的技术.,36,5.按仪器分类： 填充柱气相色谱仪 毛细管气相色谱仪 气相色谱仪 裂 解 气相色谱仪 顶 空 气相色谱仪 高 效 液相色谱仪 液相色谱仪 高效毛细管电泳仪 毛 细 管电色谱仪,37,薄层色谱仪 平面色谱仪 薄层电泳色谱仪 纸色谱仪,38,第一节 色谱法概述 第二节 色谱流出曲线(色谱图)及 有关参数 第三节 色谱理论 第四节 分离度及色谱分离方程 第五

15、节 色谱定性、定量方法 qualitative and quantitative analysis in chromatograph,结束,第九章 色谱分析方法导论,39,9.2 色谱流出曲线（色谱图）及有 关参数 一 色谱法分离的过程： 分离过程：迁移 扩散,40,混合组分的分离过程及检测器对各组份在不同阶段的响应,41,42,43,二. 色谱图的参数 （一）色谱流出曲线和色谱峰 从流动相带着组分进入色谱柱起就用检测器检测 流出柱后的流动相，并用记录器记录信号随时间 变化的曲线，此曲线就叫色谱流出曲线，当待测 组分流出色谱柱时，检测器就可检测到其组分的 浓度，在流出曲线上表现为峰状，叫色谱峰

16、。,44,如图所示为一色谱流出曲线：,45,茶叶中的维生素,VB6,VB2,46,（二）基线 在实验操作条件下，色谱柱后没有样品组分流出时的流出曲线称为基 线，稳定的基线应该是一条水平直线。,47,（三）噪音和漂移,噪音：仪器本身所固有的，以噪音 带表示（仪器越好，噪音越小） 漂移：基线向某个方向稳定移动 （仪器未稳定造成）,48,（四）峰高（h）和峰面积 ： 色谱峰顶点与基线的距离叫峰高。色谱峰与峰底基线所围成区域的面积叫峰面积。,h,峰面积,49,(五) 色谱峰宽,色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一， 衡量色谱柱的柱效及反映色谱操作条件下的动力学因素。 宽度越窄，其效率越高，分离

17、的效果也越好。,50,用来衡量色谱峰宽度的参数，有三种表示方法： （1）标准偏差()：即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。 （2）半峰宽(Y1/2)：色谱峰高一半处的宽度 Y1/2 =2.354 （3）峰底宽(Wb)：Wb=4 ,51,三、色谱流出曲线与术语,(六.)保留值,1. 保留时间（tR）：组分从进样到柱后出现浓度极大值时 所需的时间；,（动画）,（1）时间表示的保留值,52,2. 死时间 tm 不被固定相吸附或溶解 的物质进入色谱柱时， 到出现峰极大值所需的 时间称为死时间.,3. 调整保留时间（tR ）：tR= tRtM,53,由于组分在色谱柱中的保留时间tr包含了组分随流动相通

18、过柱子所须的时间和组分在固定相中滞留所须的时间，所以tr实际上是组分在固定相中保留的总时间。 保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组分的保留时间常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积来表示保留值。,54,（2）用体积表示的保留值,1 保留体积（VR）： VR = tRF0 F0为柱出口处的载气流量， 单位：m L / min。 2 死体积（VM）： VM = tM F0 3 调整保留体积(VR)： V R = VR VM,（动画）,55,死体积V0： 色谱柱管内固定相颗粒间空隙、色谱仪管路和连接头间空隙和检测器间隙的总和。忽略后两项可得到：,56,保留体积Vr： 指从进样到待测

19、物在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。 Vr=t r F0,57,6. 调整保留体积 Vr ： 某组份的保留体积扣除死体积后的体积。,58,三. 色谱流出曲线的意义： 色谱峰数=样品中单组份的个数； 色谱保留值定性依据； 色谱峰高或面积定量依据； 色谱保留值或区域宽度色谱柱分离效 能评价指标； 色谱峰间距固定相或流动相选择是否 合适的依据。,59,各种维生素的混合标样,60,四 描述分配过程的参数 1、分配系数(K)： 分配色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次地分配过程. 吸附色谱的分离是基于反复多次地吸附一脱附过程。这种分离过程经常用样品在两相间的分配来描述， 而描述

20、这种分配的参数称为分配系数 K,61,分配系数（ partion factor） K,组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（单位：g / mL）比，称为分配系数，用K 表示，即：,分配系数是色谱分离的依据。,62,分配系数 K 的讨论,一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢； 试样一定时，K主要取决于固定相性质； 每个组份在各种固定相上的分配系数K不同； 选择适宜的固定相可改善分离效果； 试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础； 某组分的K = 0时，即不被固定相保留，最先流出。,63,GC 试样一定时,K

21、主要取决于固定相性质.一定温度下，组分的分配系数 K越大，出峰越慢 每组份在各种固定相上的分配系数K不同； 选择适宜的固定相可改善分离效果；,64,试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础 K较小的组分在色谱分析中每次分配后在流动相中的浓度较大，因此较早流出色谱柱. K较大的组分每次分配后在流动相中浓度较小，因此较晚流出色谱柱。,65,当分配次数足够多时，就能将具有不同K的 组分分开。 所以，色谱法是利用不同的物质具有不同的 K而进行分离的。 K 的不同则是由于各组分在固定相流动相中的溶解度或吸附能力不同而造成的。,66,2. 分配比： k 在一定温度和压力下，组份在两相间的分配达平衡时，分配

22、在固定相和流动相中的质量比，称为分配比。它反映了组分在柱中的迁移速率。又称保留因子。也叫容量因子或容量比。,67,.分配比 （partion radio）k,在实际工作中，也常用分配比来表征色谱分配平衡过程。分配比是指，在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比：,1. 分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数，随分离柱温度、柱压的改变而变化。 2.分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数，数值越大，该组分的保留时间越长。 3. 分配比可以由实验测得。,分配比也称： 容量因子(capacity factor)；容量比(capacity factor)；,68,其

23、中VmV0，Vs为固定相体积,69,分配比 k 的求算： k也等于组分的校正保留时间与死时间的比值,因此，k可通过实验测得。由此也可知道，k可表示出组分在柱中停留时间的长短。k越大，停留时间也就越长。,70,. K 与 k 的关系：,71,3. 选择因子(相对保留值) ： 色谱柱对A、B两组分的选择因子 定义如下：组分B与组分A调整保留值之比：,A为先流出的组分，B 为后流出的组分。相对保留值只与柱温和固定相性质有关，与其他色谱操作条件无关，它表示了固定相对这两种组分的选择性。,72,注意： K 或 k 反映的是某一组分在两相间的分配 是反映两组分间的分离情况！ 当两组分 K 或 k 相同时，

24、 =1 时，两组分不能分开。,73,当两组分 K 或 k 相差越大时， 越大，分离得越好。 也就是说，两组分在两相间的分配系数不同，是色谱分离的先决条件, 和 k 是计算色谱柱分离效能的重要参数！,74,分配系数 K 及分配比 k 与选择因子的关系 对A、B两组分的选择因子，用下式表示： = tr (B) / tr (A) = k（A） / k（B） =K（A） / K（B） 通过选择因子(相对保留值）把实验测量值k与热力学性质的分配系数K直接联系起来.,75,对固定相的选择具有实际意义。 如果两组分的K 或k值相等，则=1,两个组分的色谱峰必将重合，说明分不开。 两组分的K或k值相差越大，则

25、分离得越好。 因此 两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条件。,76,下图是 A、B两组分沿色谱柱移动时，不同位置处的浓度轮廓。 溶质A和B在沿柱移动时不同位置处的浓度轮廓,KA KB,A,B,沿柱移动距离 L,A,B,浓 度,77,图中KAKB ， 因此，A组分在移动过程中滞后。 随着两组分在色谱柱中移动距离的增加，两峰间的距离逐渐变大， 同时，每一组分的浓度轮廓（即区域宽度）也慢慢变宽 显然，区域扩宽对分离是不利的，但又是不可避免的。,78,若要使A、B组分完全分离，必须满足以下三点： 第一，两组分的分配系数必须有差异； 第二，区域扩宽的速率应小于区域分离的速 度； 第三，在保证快速分

26、离的前提下，提供足够长 的色谱柱。 第一、二点是完全分离的必要条件。,79,4 塔板数n,色谱柱长：L，虚拟的塔板间距离：H， 色谱柱的理论塔板数：n，则三者的关系为： n = L / H,组分在色谱柱中的分配次数，塔板数越大，平衡次数越多，组分与固定相和流动相作用越强，柱效越高.,80,式中：tR为某组分的保留时间； W1/2为某组分色谱峰的半宽度； W为色谱峰的峰底宽度。 由式可见，柱子的理论塔板数与峰宽和保留时间有关。保留时间越大，峰越窄，理论塔板数就越多。柱效能也就越高。,理论塔板数与色谱参数之间的关系为：,81,5 分离度 R 分 离 度 R 是一个综合性指标。 它是既能反映柱效率又

27、能反映选择性的指标，称总分离效能指标。 分离度又叫分辨率，它定义相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰底宽总和之半的比值，即 R = 2 (tr2 - tr1) / Y1 +Y2,82,R = (tr2 - tr1) / Y21/2+Y11/2 R值越大，表明相邻两组分分离越好。 一般说，当R1时，两峰有部分重叠； 当R=1时，分离程度可达98%； 当R=1.5时，分离程度可达99.7%。,83,84,第一节 色谱法概述 第二节 色谱流出曲线(色谱图)及 有关参数 第三节 色谱理论 第四节 分离度及色谱分离方程 第五节 色谱定性、定量方法 qualitative and quantitati

28、ve analysis in chromatograph,结束,第九章 色谱分析方法导论,85,9.3 色谱法基本原理 色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离. 组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。,86,但当两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。 这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。 因此，要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。,87,色谱理论,色谱理论需要解决的问题：色谱分离过程的热力学和动力学问题。影响分离及柱效的因素与提高柱效

29、的途径，柱效与分离度的评价指标及其关系。,组分保留时间为何不同？色谱峰为何变宽？ 组分保留时间：色谱过程的热力学因素控制； （组分和固定液的结构和性质） 色谱峰变宽：色谱过程的动力学因素控制； （两相中的运动阻力，扩散） 两种色谱理论：塔板理论和速率理论；,88,1.塔板理论（plate theory） 半经验理论； 将色谱分离过程比拟作蒸馏过程，将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复 （类似于蒸馏塔塔板上的平衡过程）； 最早由Martin等人提出塔板理论，把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，同时引人理论塔板数作为衡量柱效率的指标。,（动画）,8

30、9,塔板理论是描述色谱柱中组分在两相间的分配状况及评价色谱柱的分离效能的一种半经验式的理论 将一根色谱柱当作一个由许多塔板组成的精馏塔，用塔板概念来描述组分在柱中的分配行为。,90,塔板是从精馏中借用的，但它成功地释了色谱流出曲线呈正态分布,。,91,(一)塔板理论的假设： (1) 在每一个平衡过程间隔内，平衡可以迅速达到； (2) 将载气看作成脉动（间歇）过程； (3) 试样沿色谱柱方向的扩散可忽略； (4) 每次分配的分配系数相同。,92,塔板之间不连续； 塔板之间无分子扩散； 组分在各塔板内两相间的分配瞬间达至平衡， 达一次平衡所需柱长为理论塔板高度H； 某组分在所有塔板上的分配系数相同

31、 流动相以不连续方式加入，即以一个一个的塔板体积加入。,93,塔板理论是把色谱柱假想为一个精馏塔，塔内存在许多塔板. 组分在每个塔板的气相和液相间进行分配，达成一次分配平衡。 然后随着流动相按一个塔板、一个塔板的方式向前移动。经过多次分配平衡后，分配系数小的组分，先离开蒸馏塔（色谱柱）， 分配系数大的组分后离开蒸馏塔（色谱柱）， 从而使分配系数不同的组分彼此得到分离。,94,经过多次分配平衡后，分配系数小的组分，先离开蒸馏塔（色谱柱）， 分配系数大的组分后离开蒸馏塔（色谱柱）， 从而使分配系数不同的组分彼此得到分离。,95,分离过程如下图所示,96,97,下面我们再举一个例子说明组分在色谱柱中

32、的分配情况。 为简单起见，设色谱柱由5决塔板（n=5n为柱子的塔板数）组成，并以塔板编号r表示 r=0，1，2，3，4，5；某组分的分配比k=1。,98,根据上述假定在色谱分离过程中。该组分的分布可计算如下： 开始时，将单位质量（即 m=1）的该组分进入0号塔板上， 然后将流动相以一个板体积（V）一个板体积的脉动形式进入色谱柱； 此时组分将安下表所示在固定相和流动相进行分配：,99,100,按上述分配过程，对于n=5，k=1，m=1的体系，随着进入柱中板体积载气的增加，组分分布在柱内任一板上的总量（气相和液相的总质量）见下表：,101,102,103,104,由表中可见，当n=5时，即5个塔板

33、体积的流动相进入柱中时，组分就开始从柱口流出。并且呈现先小后大的情况。,105,以上是当塔板数为5时的情况，出现的峰形不对称 ，这是由于塔板数太少的原因。 所以色谱峰一般为正态分布。 当塔板数大于50时，峰形就是对称的。在实际色谱柱中，n值很大（约为106 109 ）。,106,（二）柱效能指标： 对于一个色谱柱来说，其分离能力（叫柱效能）的大小主要与塔板的数目有关，塔板数越多，柱效能越高。 色谱柱的塔板数可以用理论塔板数和有效塔板数来表示。,107,式中：tR为某组分的保留时间； W1/2为某组分色谱峰的半宽度； W 为色谱峰的峰底宽度。 由式可见，柱子的理论塔板数与峰宽和保留时间有关保留时

34、间越大，峰越窄，理论塔板数就越多。柱效能也就越高。,1理论塔板数n： 对于一个柱子下说，其理论塔板数可由下式计算：,108,对于一个柱长固定为L的柱子，其理论塔板高度H为 每一个塔板的高度，即组分在柱内每一次分配平衡所需要的柱长叫理论塔板高度。它越小，也表示柱效能越高。,109,2有效塔板数n有效： 在以上计算理论塔板数的式子中使用的是保留时间，它包括了死时间，它与组分在柱内的分配无关，因此不能真正反映色谱柱的柱效。为此，引入了有效塔板数的概念。,同理有效塔板高度为,110,3.塔板理论的特点和不足,(1)当色谱柱长度一定时，塔板数 n 越大(塔板高度 H 越小)，被测组分在柱内被分配的次数越

35、多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。,(2)不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。,(3)柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。,(4)塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。,111,二速率理论范弟姆特方程式： 塔板理论是一个半经验性的理论。它定性的给出了板高的概念，但不能指出影响板高的因素。速率理论就是在塔板理论的基础上，给出了影响塔板高度的因素：,112,速率理论-影响柱效的因素,1. 速率方程（也

36、称范.弟姆特方程式） H = A + B/u + Cu H：理论塔板高度， u：载气的线速度(cm/s),减小A、B、C三项可提高柱效； 存在着最佳流速； A、B、C三项各与哪些因素有关？,113,1956年荷兰学者van Deemter等在研究气液色谱时，提出了色谱过程动力学理论速率理论。他们吸收了塔板理论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而在动力学基础上较好地解释了影响板高的各种因素。,114,该理论模型对气相、液相色谱都适用。 van Deemter方程的数学简化式为,115,u 为流动相线速度； A，B，C为常数，其中 A表示涡流扩散； B分子扩散； C传质阻力

37、（包括液相和固相传质阻力系数）。,116,该式从动力学角度很好地解释了影响板高（柱效）的各种因素！ 任何减少方程右边三项数值的方法，都可降低H，从而提高柱效。,117,1）涡流扩散项(A) 在填充柱中，由于受到固定相颗粒的阻碍，组份在迁移过程中随流动相不断改变方向，形成紊乱的“涡流”：从图中可见，因填充物颗粒大小及填充的不均匀性同一组分运行路线长短不同流出时间不同峰形展宽。展宽程度以A表示：,流动方向,118,A涡流扩散项,A = 2dp dp：固定相的平均颗粒直径 ：固定相的填充不均匀因子,固定相颗粒越小dp，填充的越均匀，A，H，柱效n。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄

38、。,（动画）,119,形象地如图所示。,展宽程度以A表示：,120,可见，使用细粒的固定相并填充均匀可减小A，提高柱效。 对于空心毛细管柱，无涡流扩散，即A=0。,其中 dp填充物平均直径；填充不规则因子。,A=2dp,121,122,2）分子扩散项(B/u) 纵向分子扩散是由于浓度梯度引起的。 当样品被注入色谱柱时，它呈“塞子”状分布。随着流动相的推进， “塞子”因浓度梯度而向前后自发地扩散，使谱峰展宽。,123,B/u 分子扩散项,B = 2 Dg ：弯曲因子，填充柱色谱，1。 Dg：试样组分分子在气相中的扩散系数（cm2s-1） (1) 存在着浓度差，产生纵向扩散; (2) 扩散导致色谱

39、峰变宽，H(n)，分离变差; (3) 分子扩散项与流速有关，流速，滞留时间，扩散; (4) 扩散系数：Dg (M载气)-1/2 ； M载气，B值。,（动画）,124,125,展宽程度以B表示： B=2D 称为弯曲因子，它表示固定相几何形状对自由分子扩散的阻碍情况； D组分在流动相中的扩散系数。组份为气体或液体时，分别以Dg或Dm表示；,126,3）传质阻力项(Cu) 因传质阻力的存在，使分配不能“瞬间”达至平衡，因此产生峰形展宽。气相色谱以气体为流动相，液相色谱以液体为流动相，二者传质过程不完全相同。下面分别作讨论。,127,气相传质过程是指试样组分从气相移动到固定相表面的过程。这一过程中试样

40、组分将在两相间进行质量交换，即进行浓度分配。有的分子还来不及进入两相界面，就被气相带走；有的则进人两相界面又来不及返回气相。这样，使得试样在两相界面上不能瞬间达到分配平衡，引起滞后现象，从而使色谱峰变宽,128,（2）对于液液分配色谱， 传质阻力系数（C）包含流动相传质阻力系数（Cm）和固定相传质系数（Cs），即 CCmCs 其中Cm又包含流动的流动相中的传质阻力和滞留的流动相中的传质阻力，,129,讨论： 流动相传质阻力包括两方面：流动相中的传质阻力Cm、滞留的流动相传质阻力Cs 。分别与填充物大小 dp、扩散系数(Dm)、微孔大小及其数量等有关 因此，降低固定相传质阻力的方法有。,130,

41、因此，降低流动相传质阻力的方法有：细颗粒固定相、增加组分在固定相和流动相中的扩散系数D、适当降低线速度、短柱。 固定相传质阻力与液膜厚度df、保留因子 k 和扩散系数Ds等有关。,131,4）流速u 由方程 H = A + B/u + Cu知道： 当u一定时，仅在A、B、C 较小时，H 较小，柱效较高；反之则柱效较低，色谱峰将展宽。 以u对H作图，可得H-u曲线（如图），从该曲线得到：,132,133,134,135,载气流速与柱效最佳流速,载气流速高时： 传质阻力项是影响柱效的主要因素，流速，柱效。 载气流速低时： 分子扩散项成为影响柱效的主要因素，流速,柱效 。,H - u曲线与最佳流速：

42、 由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影响使得存在着一个最佳流速值，即速率方程式中塔板高度对流速的一阶导数有一极小值。 以塔板高度H对应载气流速u作图，曲线最低点的流速即为最佳流速。,136,涡流扩散项A与流速u无关； 低流速区(u小)， B/u大，分子扩散项占主导， 此时选择分子量大的气体如N2和Ar为载气，可减小扩散，提高柱效； 高流速区(u大)， Cu大，传质阻力项占主导， 此时选择分子量小的气体如H2和He为载气，可增加扩散系数，提高柱效；,137,H = A + B/u + Cu,对上式求导数，当H最小时， 一阶导数为零： dH/du= B/u2 +C=0 u最佳= (B/

43、C) 1/2 故H最小 =A+2（BC）1/2,138,曲线的最低点对应最佳线速uopt( ) 下的最小板高Hmin( )；,LC的Hmin和uopt均比GC的小一个数量级，即在 LC中，较低流速可获得较大的柱效。,139,H = A + B/u + Cu,式从动力学角度很好地解释了影响板高（柱效）的各种因素！ 任何减少方程右边三项数值的方法，都可降低H，从而提高柱效。,140,5 固定相颗粒大小对板高的影响 实验表明，颗粒越细，板高越小，受线速影响小。 即 在HPLC分析中采用细粒作固定相的理论根据！ 但 颗粒细导致柱流速慢，当采用高压技术，才能实现HPLC的分析要求。,141,板高, H(

44、cm),142,上面分别介绍了影响色谱分离的基本原理以及影响柱效的各种因素. 但是如何从总体上定量描述色谱分离效能？ 如何将各种影响因素对分离的影响定量地表述出来呢？,143,第一节 色谱法概述 第二节 色谱流出曲线(色谱图)及 有关参数 第三节 色谱理论 第四节 分离度及色谱分离方程 第五节 色谱定性、定量方法 qualitative and quantitative analysis in chromatograph,结束,第九章 色谱分析方法导论,144,9.4 分离度及色谱分离方程,用此式，可直接从色谱流出曲线上求出分离度R。,一、分离度(Resolution, R) 同时反映色谱柱效

45、能和选择性的一个综合指标。也称总分离效能指标或分辨率。其定义为：,145,色谱分离中的四种典型情况, 分离效果差，柱效低，选择性（ ）低 完全分离，柱效高，峰窄，选择性（ ）低 ； 完全分离，选择性（ ）增加，柱效低，峰宽 完全分离，柱效高，选择性（）好,146,讨论：,色谱分离中的四种情况的讨论：, 柱效较高，K(分配系数)较大,完全分离； K不是很大，柱效较高，峰较窄，基本上完全分离； 柱效较低，K较大,但分离的不好； K小，柱效低，分离效果更差。,147,R值越大，表明相邻两组分分离越好。 一般说，当R1时，两峰有部分重叠； 当R=1时，分离程度可达98%； 当R=1.5时，分离程度可达

46、99.7%。 通常用R=1.5作为相邻两组分已完全分离的标志。 。,148,149,二、色谱分离方程 R 的定义并未反映影响分离度的各种因素。也就是说，R 未与影响其大小的因素：柱效n、选择因子 和保留因子 k 联系起来。 对于相邻的难分离组分，由于它们的分配系数 K 相差小，可合理假设k1k2=k，W1 W2=W。因此可导出R与n、 和 k 的关系：,150,：,151,有关色谱方程的讨论,1）分离度R 与柱效的关系 分离度R与理论塔板数n 有关，即R 受热力学性质的影响。 分离度与柱效的平方根成正比， R一定时，增加柱效，可提高分离度，但组分保留时间增加且峰扩展，分析时间长。,152,对具

47、一定相对保留值 的物质对，R与有效塔板数neff有关，说明neff可正确代表柱效能。 由色谱方程可得：,因此可通过增加柱长提高分离度。然而，分析时间也相应增加，且峰宽也展宽！为提高柱效，用减小塔板高度 H 的方法比增加柱长更有效。,n = L / H,153,2）分离度R与保留因子 的关系 的微小变化可引起 R 较大改变. 如 当 从1.01增加至1.10(增加9% )时，R 则增加 9 倍(但1.5, R增加不大) 改变 的方法有：降低柱温、改变流动相及固定相的性质和组成。 。,154,改变组分的值方法： 改变固定相, 使各组分的分配系数有较大差别。 改变柱温。柱温的改变对不同组分的分配系数

48、的影响不同。采用较低柱温, 一般有利于增大值。 改变流动相的性质和组成。 利用化学衍生法改变组分的性质, 从而改变它们的分配系数。,155,3）分离度R 分配比 k 的关系,k 增加，分离度R 增加，对于一个具体的色谱分离，k值应该多大？,156,157,可见, 过大的k(10), 使k/(1+k)的改变不大, 对R的改进不明显, 反而使保留时间大为延长。 使k改变的方法有： 改变柱温（如GC） 改变流动相性质和组成(在LC中) 改变相比,158,结论： 值很小的变化, 可使有较大的变化。 值趋近于1时, 它的改变对的增加R尤为显著；值较大时, 对R的影响反而减少。 在k、N、三个参数中, 的

49、增加对分离的改进最有效。k从1增加3, R只增加到原来的1.5倍。N增加到原来的3倍, 而R只增加到原来的1.7倍。从1.01增加带1.1, 约增加9 %, 而Rs却增加到原来的9倍。,159,色谱分离中的问题 由于分析物组成复杂，以某一组成的流动相可能使部分待测物得到好的分离，但同时又使其它待测物的分离不令人满意！ GC 实际工作中采用程序升温解决。 LC 采用梯度淋洗来解决这个问题。,160,70%CH3OH +30H2O,60%CH3OH +40H2O,50%CH3OH +50H2O,40%CH3OH +60H2O,161,162,5 基本色谱分离方程式的应用 在实际中，基本色谱分离方程

50、式是很有用的公式，它将柱效、选择因子、分离度三者的关系联系起来了，知道其中两个指标，就可计算出第三个指标。,163,例9-3 已知一色谱柱在某温度下的速率方程的A=0.08cm; B=0.65cm2/s; C=0.003s, 求最佳线速度u和最小塔板高H. 解: 欲求 u最佳和H最小,要对速率方程微分,即 dH/dud(A+B/u+Cu)/du -B/u2+C0,164,而,最佳线速: u最佳(B/C)1/2 最小板高: H最小A+2(BC)1/2 可得 u最佳(0.65/0.003)1/214.7cm/s H最小0.08+2(0.650.003)1/20.1683cm,165,例9-4 已知

51、物质A和B在一根30.00 cm长的柱上的保留时间分别为16.40 min和17.63 min。不被保留组分通过该柱的时间为1.30 min。峰底宽度分别为1.11 min和1.21 min， 计算： （1）柱的分离度； (2） 柱的平均塔板数；n,166,R = 2(17.63-16.40)/(1.11+1.21)=1.06 nA= (16.40/1.11)2=3493 nB=16(17.63/1.21)2=3397 nav= (3493+3397)/2 = 3445 = 3.44103,167,例：两物质A和B在30cm长的色谱柱上的保留时间分别为16.4和17.63min，有一不与固定相

52、作用的物质，其在此柱上的保留时间为1.30 min。物质A和B的峰底宽分别为1.11和1.21min。试问： 1）柱分辨率R； 2）柱平均理论塔板数nav 3）平均塔板高度Hav,168,4）若要求R达到1.5，则柱长至少应为多少？ 5）使用上述较长的柱进行分析时，其分析时间为多长？ 6）不增加柱长，要求在原来的分析时间内R达到1.5，该柱的塔板高度应为多少？,169,1）柱分辨率R；,170,2）柱平均理论塔板数nav,171,3）平均塔板高度Hav,172,4）若要求R达到1.5，则柱长至少应为多少？,173,5）使用上述较长的柱进行分析时，其分析时间为多长？,174,6）不增加柱长，要求

53、在原来的分析时间内R达到1.5，该柱的塔板高度应为多少？,175,第一节 色谱法概述 第二节 色谱流出曲线(色谱图)及 有关参数 第三节 色谱理论 第四节 分离度及色谱分离方程 第五节 色谱定性、定量方法 qualitative and quantitative analysis in chromatograph,结束,第九章 色谱分析方法导论,176,一 、色谱的定性分析 色谱定性分析就是要确定各色谱峰所代表的化合物。 由于各种物质在一定的色谱条件下均有确定的保留值，因此保留值可作为一种定性指标。,第五节 色谱定性、定量方法,177,目前各种色谱定性方法都是基于保留值的。 但是不同物质在同一

54、色谱条件下，可能具有相似或相同的保留值，即保留值并非专属的。 因此仅根据保留值对一个完全未知的样品定性是困难的。 如果在了解样品的来源、性质、分析目的的基础上，对样品组成作初步的判断，再结合下列的方法则可确定色谱峰所代表的化合物。 纯物质对照法定性只适用于组分性质已有所了解，组成比较简单，且有纯物质的未知物,178,（一）利用纯物质对照定性 （二）相对保留值法 （三） 加入已知物增加峰高法 ( 四) 与其他方法结合,一、色谱定性鉴定方法,179,（一）利用纯物质对照定性 在一定的色谱条件下，一个未知物只有一个确定的保留时间。 因此将已知纯物质在相同的色谱条件下的保留时间与未知物的保留时间进行比

55、较，就可以定性鉴定未知物。,180,若二者相同，则未知物可能是已知的纯物质；不同，则未知物就不是该纯物质。 纯物质对照法定性只适用于组分性质已有所了解，组成比较简单，且有纯物质的未知物。,181,182,菊花乙醇提取样品,183,绿原酸+槲皮素混合标样30ug,184,185,（二）相对保留值法 相对保留值is 是指组分i与基准物质s调整保留值的比值 is = tri / trS= Vri / Vrs 它仅随固定液及柱温变化而变化，与其它操作条件无关。,186,相对保留值测定方法： 在某一固定相及柱温下，分别测出组分i和基准物质s的调整保留值，再按上式计算即可。用已求出的相对保留值与文献相应值

56、比较即可定性。 通常选容易得到纯品的，而且与被分析组分相近的物质作基准物质，如正丁烷、环己烷、正戊烷、苯、对二甲苯、环己醇、环己酮等。,187,.保留指数,又称Kovats指数()，是一种重现性较好的定性参数。测定方法： 将正构烷烃作为标准，规定其保留指数为分子中碳原子个数乘以100（如正己烷的保留指数为600）。 其它物质的保留指数（IX）是通过选定两个相邻的正构烷烃，其分别具有Z和Z1个碳原子。被测物质X的调整保留时间应在相邻两个正构烷烃的调整保留值之间如图所示：,188,（三）加入已知物增加峰高法 当未知样品中组分较多，所得色谱峰过密，用上述方法不易辨认时，或仅作未知样品指定项目分析时均

57、可用此法。首先作出未知样品的色谱图，然后在未知样品加入某已知物，又得到一个色谱图。峰高增加的组分即可能为这种已知物。,189,槐花叶样品2,190,槲皮素+芦丁混合标样125ug,191,槲皮素+芦丁混合标样100ug+槐叶样品2,192,红色 样品 黑色 样品+标样 蓝色 标样,193,( 四) 与其他方法结合 色谱与质谱、Fourier红外光谱、发射光谱等仪器联用是目前解决复杂样品定性分析最有效工具之一。 LC/MS GC/MS CE/MS ICP/MS,194,小型化的台式色质谱联用仪（GC-MS；LC-MS） 色谱-红外光谱仪联用仪； 组分的结构鉴定,195,二、色谱定量分析 定量分析

58、的任务是求出混合样品中各组分的百分含量。色谱定量的依据是，当操作条件一致时，被测组分的质量（或浓度）与检测器给出的响应信号成正比。即： mi = fi Ai 式中mi为被测组分i的质量； Ai为被测组分i的峰面积； fi为被测组分i的校正因子。可见，进行色谱定量分析时需要：,196,定量的理论依据,在一定的操作条件下，被分析的物质质量 与检测器产生的信号成正比,197,二、 色谱定量分析方法,1. 峰面积的测量 （1）峰高（h）乘半峰宽（Y 1/2）法：近似将色谱峰当作等腰三角形。此法算出的面积是实际峰面积的0.94倍： A = 1.064 hY1/2 （2）峰高乘平均峰宽法：当峰形不对称时，可在峰高0.15和0.85处分别测定峰宽，由下式计算峰面积： A = h（Y 0.15 + Y 0.8