《酶免检测技术影响》PPT课件.ppt

1、酶免检测技术影响因素,检验科 马燕,酶免技术的分类 实验注意事项 实验中常见问题及解决方法,均相法 双抗原夹心法（测抗体） 直接法 双抗体夹心法（测抗原） 酶免法 间接法 测抗体、抗原 EIA 非均相法 ELISA 竞相法 测抗体、抗原 捕获法 测IgM抗体 enzyme-linked immunosorbent assay 酶联免疫吸附测定法,酶免技术的分类,双抗体夹心法 HBsAg、 HBeAg 双抗原夹心法 HBsAb,夹心法,HBcAb、 HBeAb,竞争法,HDV IgG/M、 HEV IgG/M 测IgG 测IgM,间接法,HAV-IgM,捕获法测IgM,实验注意事项,1、标本 避

2、免溶血 尽量新鲜，避免细菌污染 一般5天内检测的血清可4保存，否则低温保存。,2、试剂 使用前平衡至室温 配置洗液应使用去离子水或蒸馏水，保证水的新鲜 3、设计实验 设计好孔位，通常阴阳对照孔各2孔、空白1孔。 必要时做好标注，避免错误,4、加样 样品应全部加于反应孔底部，避免液体悬挂在孔壁上。 加样量准确！ 加下一标本时更换吸嘴,5、加酶结合物 一般使用滴瓶滴加 滴加时应保持瓶身垂直、加液速度适中，使液滴大小均匀一致 一步法时先加样本后加酶，不可颠倒顺序 一般空白孔只加底物和终止液，而不能加入其它物质，尤其是酶结合物,6、温育 温度、时间要严格控制！ 最好使反应杯尽快升温到所需温度 最好放入

3、湿盒或水浴箱中 反应板贴上即时贴 微孔板放入水浴箱后，孔内温度上升到37需要一定时间。但实际工作中很少有人注意这个问题，通常是放入即计时，导致实际温育时间不够，弱阳性标本漏检。 解决：微孔板放水面上或湿盒中纱布浸透水，使板底部直接与37接触，迅速达到温度。,7、洗板 使用专用洗涤液 一般洗涤46次 若手工洗涤， 前两次洗涤应不溢出反应孔 污染 后面几次洗涤应加满所有孔 干净 每次加洗涤液后应浸泡30秒再甩去洗液 反应板倒扣吸水纸上拍干 洗板时应注意非离子去垢剂的浓度。洗液中Tween20高于0.2%,可使包被子固相上的抗体抗原解吸附而影响测定下限。,8、加底物 底物A液通常是H2O2 还原剂

4、底物B液通常是TMB（3、3、5、5 -四甲基联苯胺） 氧化剂 TMB氧化后呈蓝色，被2N H2SO4 终止后呈黄色，450nm波长处有最大吸收峰 底物B应避光保存，实验时加完底物A、B保温时也应避光保存。,9、比色 空白孔校零，读取各孔OD值 单波长or双波长的选择： 单波长通常是对显色具有最大吸收的450nm或492nm 双波长酶标仪则在敏感波长450nm和非敏感波长630nm下各测定一次。使用双波长时不必设定空白孔，否则会造成孔吸光度数为负数。 若底物为OPD（邻苯二胺），波长为492nm 若底物为TMB， 波长为450nm,10、结果判读 不同试剂，CUTOFF值计算方法不同,常见问题

5、及解决办法,内源性标本因素： 1、类风湿因子：一般为IgM型，可与变性IgG Fc段非特异结合，因此可能与包被的IgG以及随后加入的酶标IgG结合而产生假阳性。 2、补体：包被抗体及随后加入的酶标抗体均能激活补体而与补体C1q位点结合而产生假阳性，也可降低检测物与固相结合而引起假阴性或测值偏低 3、异嗜性抗体：人血清中含有抗 齿类动物（羊、鼠等）Ig的抗体，即天然异嗜性抗体。与酶标二抗出现假阳性。 4、溶菌酶：可与等电点5的低等电点蛋白强结合，双抗体夹心法ELISA可假阳性。 外源性标本因素： 1、溶血：Hb中的血红素集团有类似过氧化物的活性，温育时吸附固相可与HRP显色。 2、细菌污染：细菌分泌的一些酶可对抗原抗体蛋白分解或直接影响酶标抗体作用，并且细菌引起标本混浊。 3、标本4存放过久：IgG聚合成二聚体，间接法中易假阳性。建议1周 4、标本凝固不全：残留纤维蛋白原形成