第四章 植物原生质体培养及细胞融合(1).ppt

1、原生质体培养与细胞融合,第一节 原生质体培养,一、 原生质体的培养概况 1、概念： 植物的原生质体(Protoplast)指除去细胞壁以后的裸露细胞。 原生质体培养（Protoplast culture）是将植物细胞游离成原生质体，在适宜的培养条件下，使其再生细胞壁，进而细胞进行持续分裂形成细胞团，进一步生长形成愈伤组织或胚状体，最后分化或发育形成完整植株的过程。 原生质体培养特点是：比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA；便于进行细胞融合，形成杂交细胞；与完整细胞一样具有全能性，仍可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。 原生质培养首先在烟草上获得成功Nagata c 渗透调节物含量高（0.3-0

2、.5mol/L甘露醇); d 维生素含量高。 培养条件：a 光照：初期暗培养4-7d ，形成细胞团后再移到光下培养。b 温度：25-30（261 ）; c 湿度：过高过低都不利，70-80% 。,柱花草,第二节 植物细胞融合（体细胞杂交）,体细胞杂交（Somatic cell hybridization）： 通过物理或化学的方法使原生质体融合，通过培养获得具有双亲遗传物质的后代。也叫做原生质体融合（protoplast fusion）。,体细胞杂交的重要性 实现远缘遗传重组，创造新遗传种质。常规的有性远缘杂交育种的一大障碍是存在生殖隔离和杂交不亲和性；通过原生质体融合在细胞水平上进行无性杂交，

3、绕过有性过程这一环节，有可能克服上述障碍，培育出自然条件下不能得到、具有各种优良性状的作物新品种，又称超性杂交。 Melchers（1978）番茄-马铃薯杂种。泡马豆（pomato，po(tato)-（to）mato。 实现核质互作的遗传性状组合，特别是双亲质基因组（线粒体基因、叶绿体基因）的组合，将位于细胞质的雄性不育性、抗病性、杀虫剂抗性遗传给子代，产生细胞质杂种。 Chuong（1988）将分别为胞质雄性不育与抗阿特拉津两个单倍体油菜的原生质体融合，得到既有雄性不育又有抗阿特拉津油菜植株。,植物体细胞杂交的主要程序： 原生质体的制备 原生质体融合 杂种细胞的选择 杂种细胞的培养 杂种植株

4、的鉴定,一、原生质体融合,自发融合: 动植物细胞融合现象在自然界普遍存在。植物生殖过程的双受精，雄性生殖细胞与雌性卵细胞与中央细胞发生融合。在酶解法制备同源原生质体时，相邻细胞间发生融合。一般认为，这类融合与质膜蛋白质（识别蛋白）及胞间连丝有关。 诱导融合: 指将原生质体分离出来以后，再加入诱导剂或其它方法促使两亲本原生质体融合。是依靠诱导剂，克服不同原生质体的排斥力使之彼此融合。 诱导融合有：物理方法和化学方法,自发融合和诱导融合,1、物理方法 利用离心、振动、电刺激等物理方法促使原生质体融合。 电融合（Electrofusion）： 1）微电极控制仪：两个微电极尖端，同时与两个靠近的原生质

5、体表面接触，用512A电波15ms（毫秒）。原生质体发生暂时收缩，引起了原生质膜状态暂时变化，从点连到面再到形成球形融合体约需要2030min。 2）平行电极： 融合槽的两极通过交流电场产生电泳效应，电场产生的力作用于原生质体，使原生质偶极化，原生质体相互接触形成珍珠串。加适当强度的直流电脉冲，高强度的只需几个微秒就使细胞膜发生可逆穿击而形成融合体。,细胞融合仪,Multiporator,细胞先在交流电场中聚集，然后通过直流脉冲融合。 特定的缓冲液体系可帮助完成高效的细胞电融合。,神舟四号飞船上进行的太空细胞顺利融合，返回舱里的电融合仪内孕育出首批国产太空生命 。,2、化学方法： 以不同的试剂

6、为诱导剂，如各种盐类，多聚化合物，生物胶及其降解物等，促进原生质体融合。目前应用广泛的是Kao（1977）聚乙二醇（PEG）和高Ca2+法。 原理：带有负电荷的PEG和原生质体表面负电荷通过Ca2+ 连接形成静电键，促进原生质体间黏着和结合；在高Ca-高pH溶液处理下，Ca和PEG分子被洗脱，导致电荷平衡失调而重新分配，使原生质体某些正电荷和另一些原生质体负电荷连接、吸附、聚合，最后融合在一起。（PEG增加类脂膜的流动性，也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能）,PEG高Ca2+-pH法：,将分离好的不同原生质体悬浮液作为供试材料。 配置适宜浓度的聚乙二醇（PEG）溶液与稀释清洗液。 原生质

7、体的融合：混合等体积的两种原生质体悬浮液，加入PEG溶液并诱导两者接触、融合；用稀释清洗液冲洗（高Ca2+-pH法）。 培养,二、融合过程 膜融合：生物膜融合是重要生物学现象，常态膜融合:内胞饮、外胞饮；非常态:如受化学的、物理的、生物的（噬菌体、病毒）等因素的刺激引起细胞病理状态的反应。 从膜融合的过程来看，可以把膜融合的反应分成接触，诱导，融合，和稳定四个时期。而Ca2+、ATP、及ATP酶可调节膜融合的变化；质膜上磷脂状态的改变可以影响质膜构型和流动性的报道。 核融合：,原生质体融合过程,三、融合细胞的筛选,以X、Y分别代表两种植物的原生质体，当两者原生质体诱导融合后，原生质体群中，必然

8、含有未融合的亲本原生质体（X和Y），同种融合体（XX，YY）以及异种融合体（XY）。 植物细胞杂种的筛选方法和技术不少是借鉴于动物细胞杂交的经验，其途径大致有两类： 一种方法是设计一个选择程序，使在某种条件下只有杂种细胞生长，而任何一个亲本不能在此条件下生长，生长缓慢或中途夭折，存活下来的细胞为杂种细胞。 第二种方法是借助于显微操作技术将融合体或杂种细胞直接挑选出来进行单独培养，目前比较有发展前途的是荧光标记技术结合显微操作来筛选。,1、互补筛选法,有白化互补选择、生长互补选择、营养互补选择、基因互补选择、抗性互补选择等。,（1）生长互补选择：Carlson(1972) 烟草和郎氏烟草双亲原生

9、质体需要生长素，而杂种细胞在无生长素培养基上就可以生长。凡是在无生长素培养基上生长的细胞，就是杂种细胞。（激素自主互补选择）,（2）营养缺陷互补选择 Gleimelius(1978),以两个烟草硝酸还原酶营养缺陷型突变体为杂交亲本，它们只能在有机氮或氨态氮培养基上生长，不能在硝酸盐培养基上生长，而杂种细胞由于在遗传上的互补，可以恢复硝酸还原酶活力，所以在硝酸盐培养基上生长的细胞即为杂种细胞。,（3）白化互补选择,（4）抗性突变体互补选择,2、机械筛选： 荧光染料标记： 单标记、双标记,用不同荧光染料标记两个亲本原生质体，在融合前用能发不同颜色荧光的荧光染料进行染色。在一个融合体中有两种荧光的细

10、胞为异核体。 异硫氰酸荧光素（FITC）绿色 异硫氰酸罗丹明（RITC）红色,四、杂种植株的鉴定,1 杂种植株和亲本植株的形态学特征 2 杂种和亲本的核型分析,薄荷,18条,36条,3 、同工酶谱分析,过氧化物酶(POD)、超氧岐化酶（DOD）、脂酶、醇脱氢酶等 RuBP羧化酶：大亚基（LS）母性遗传，叶绿体DNA；小亚基（SS）孟德尔遗传，受核控制。,4、分子生物学方法 分子生物学技术的发展，扩大了鉴定植物细胞杂种分析手段。应用最多是通过双亲及杂种的DNA限制性内切酶片段图谱(RFLP)。比较线粒体和叶绿体DNA差异，从具有双亲DNA的存在直接证明是体细胞杂种。 Dudirs(1979)得到

11、胡萝卜羊角芹的染色体数经检查2n=18，都是胡萝卜染色体，但用分子杂交方法证明带有羊角芹特有的RNA，确定是体细胞杂种。 Saul等（1983）用专一的高度重复的细胞核DNA做探针，鉴定天仙子烟草的属于体细胞杂种。 Xu等（1993）利用DNA限制性片段长度多态性（RLFP）和随机扩增多态性（RAPD）检测体细胞杂种植株。,转Barnase 基因植株的PCR检测 1 HaeIII/pBR322 Marker；2阳性对照；3-7转基因材料,PCR检测(限制性片段长度多态性,RFLP）,1 2 3 4 5 6 7,Southern杂交的鉴定,转化有Barnase 基因植株的Southern blo

12、tting 分析 1阳性对照，25. 转基因植株, 6. 阴性对照,1 2 3 4 5 6,Melchers（1978）对野生番茄和马铃薯(2n=24)培养出杂种再生植株，进行了形态染色体和RUBP羧化酶谱分析，而RUBP羧化酶差异最明显。 9株杂种中全都具双亲的RUBP小亚基，而其中5株只有马铃薯的大亚基，4株具番茄的大亚基，前者称Pomatoes (马番杂种)，后者称Topatoes（番马杂种）。属间杂交的先成功，是典型的核质遗传表型杂种.在理论在实践上都有较大价值。 目前已再生植株的种内细胞杂种14个、种间62个，属间47个。 野生芥芥菜(Kirti,1995)，番茄茄(Liu, 199

13、5)。,The prospects of success with the genetic manipulation of plants has created considerable public interest. Melchers and his co-workers (1978) produced a hybrid plant from the fusion of potato and tomato protoplasts, allowing the transfer of genetic information from two different organisms. The method provides the opportunity of producing hybrids between related but sexually incompatible sp