动物干细胞培养及--2011427本科生.ppt

1、第十五章 动物干细胞技术,2011.5,主要内容,序言 干细胞的定义、分类、定位 干细胞的生物学及形态学特征 干细胞的分离纯化和培养 干细胞研究意义 干细胞的应用前景 干细胞研究中存在的问题,序 言 干细胞(stem cells,SC)：是一类具有无限增殖和自我修复能力 (self-renewing)的多潜能细胞，也称为“万能细胞” 。 1999年，Science评价：世界十大科技进展魁首 2000年，Science评价：世界十大科技进展之一 2002年，Science评价：值得关注的六大科技领域之一 2007年，Science评价：IPS(万能细胞),动物干细胞技术 指通过各种方法获得干细胞

2、，经体外培养建立细胞系，并对其进行定向分化诱导研究，以期获得需要的某一特定类型细胞。,干细胞研究历史 始于19世纪，至今已有1个世纪。 1896年，Wilson在一篇论述细胞生物学的文献中，首次使用“干细胞”这一概念，专门用于描述寄生虫生殖系的祖细胞。 1981年，Evans和Kaufman用延迟胚胎着床的方法分离胚胎内细胞团，首次成功分离得到小鼠胚胎干细胞。 2007年，科学家将成年小鼠体细胞诱导逆转成干细胞，更加为干细胞技术研究提供了新的思路。,干细胞研究意义 (1)干细胞通过核移植或胚胎嵌合，能得到克隆动物，这对提高优良家畜的繁育效率及拯救濒危动物具有重要意义。 (2)由于可以对干细胞进

3、行体外遗传操作、选择和冻存而不失其多能性，所以在特定条件下可诱导分化为人们所需要的细胞、组织和器官等并用于临床治疗。 (3)干细胞技术在生物学基础研究、农业以及移植医学上具有广阔的应用前景，其研究成果必将引起人类临床医学的一场革命。,1、干细胞的定义、分类、定位,1.1 定义 干细胞(stem cells, SC)：是一类具有无限增殖和自我修复能力 (self-renewing)的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，存在于个体的不同阶段以及成体的不同组织中。 基本特征： 自我修复 多向分化潜能,干细胞的分化及自我更新,1.2 分类： 1.2.1 根据细胞分化潜能的大小分为 全能

4、干细胞 (totipotent stem cells) 三胚层多能干细胞 (pluripotent stem cells) 单胚层多能干细胞 (multipotent stem cells) 单能干细胞 (monopotent stem cells),全能干细胞：单个细胞如能发育成一个完整的个体，就称该细胞的这种潜能为全能性。 三胚层多能干细胞 ：指细胞失去了发育成完整个体的能力，但仍具有分化成个体中各种细胞的潜能。 单胚层多能干细胞：只能分化成几种特定类型的细胞，如间充质干细胞通常只能分化成骨、肌肉、软骨、脂肪及其他结缔组织，而不能分化为除此之外的其他组织。 单能干细胞：只能分化为一种细胞，

5、如成体干细胞中的神经干细胞，只能分化为神经元，而不能分化为显形胶原或少突胶原，这种细胞称为单能干细胞。,人受精卵着床前胚胎发育过程,小鼠精卵着床前胚胎发育过程,桑葚胚（全能干细胞）,1.2.2 根据细胞来源不同分为 胚胎性干细胞(embryonic stem cell，ES细胞) 成体干细胞(adult stem cells ),（1） 胚胎性干细胞 ES细胞：指源于囊胚内细胞团(inner cell mass，ICM)的胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES) 。 EC细胞：从畸胎瘤中分离得到的多能性细胞(embryonic carcinorma cells，EC) 。

6、EG细胞：胚胎生殖细胞，从早期胎儿原始生殖细胞(primordial germ cells，PGCs )中分离到的细胞(embryonic germ cells,EG）。 均属三胚层干细胞。,胚泡（三胚层多能干细胞）,ES细胞,Embryonic stem cell,（2）成体干细胞定义： 成体干细胞是指一些具有组织特异性的细胞，它们主要用于维持细胞功能的稳定，具有修复和再生能力，能够产生新的干细胞，或者能按一定的程序分化，形成新的功能细胞，使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。,成体干细胞分类： 造血干细胞：存在于骨髓、外周血和脐带血中， 用于治疗血液系统疾病以及多种实体肿瘤。 神经干细胞：

7、存在于中枢神经系统，进一步分化成中枢神经系统的某些细胞类型。 间充质干细胞：存在于全身结缔组织和器官间质中，由于它具有向骨、软骨、脂肪、肌肉及肌腱等组织分化的潜能，因而利用它进行组织工程学研究。 表皮干细胞：位于表皮基底层，具强大的增殖分化潜能，在体外可以分化成表皮全层细胞。表皮干细胞作为组织工程皮肤的种子细胞，已经在治疗烧伤方面发挥作用。,外周血（peripheral blood）是除骨髓之外的血液。 临床上常用一些方法，把骨髓中的造血干细胞释放到血液中，再从血液中提取分离得到造血干细胞，我们把这样得到的干细胞称为外周血干细胞 。 正常人外周血中只存在有极少量（0.01%）的造血干细胞。可利

8、用细胞分离技术(血细胞自动分离机)，将外周血中含有造血干细胞的单个核细胞进行分离保存，重复数次达一定细胞数量后，回输给患者，以之代替骨髓而进行干细胞移植，称为外周血干细胞移植。,外周血,祖细胞（progenitor or precursor cell）前体细胞,发育中通过一系列分裂，能产生不同细胞谱系的细胞。 祖细胞的分化更具明确性，只能分化为一些目标细胞。 干细胞可以无限增值，而祖细胞分裂的次数是有限的，它只能分裂并产生某种类型的细胞。,祖细胞与干细胞的特点,干细胞的横向分化(transdifferentiation） -可塑性： 成体干细胞具有分化成其他细胞或组织的潜能，大部分都可以分化为

9、至少23种以上其它的组织细胞。 例如： 从骨髓间质中分离出的MAPC（多样成熟原始细胞）干细胞、从脐血中分离出的干细胞，可以在体内外分化出机体的任一组织。这种现象被称为干细胞的横向分化。,干细胞可塑性应用 该特性为干细胞的应用研究开创了更广泛的空间，有望利用病人自身健康组织产生的干细胞，诱导分化成可替代病变组织的功能细胞来治疗各种疾病。这样既克服了由于异体细胞移植而引起的免疫排斥，又避免了胚胎细胞来源不足以及其他社会伦理问题。,成体干细胞的可塑性,间充质干细胞 主要存在于全身结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，胎儿脐血中也可分离得到,2. 干细胞的生物学特性及形态学特征,2.1 干

10、细胞的生物学特性 终生保持未分化或低分化状态； 机体的数目、位置相对恒定； 具有自我更新能力； 能无限分裂增殖，干细胞可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态；,具有多向分化潜能，能分化为各种不同类型的组织细胞，即具有分化发育的可塑性； 分裂周期慢，绝大多数细胞处于G0期； 干细胞通过两种方式生长： 对称分裂，形成两个相同的干细胞， 非对称式分裂，非对称式分裂中一个保持亲代的特性，仍作为干细胞保存下来，另外一个干细胞不可逆的走向分化的终端成为功能专一的分化细胞。,2.2 干细胞的形态学特征,(1)ES细胞来自正常的胚胎，具有完整的二倍体核型。 (2)胞体体积小、核大、胞浆少、有12个核仁，

11、细胞紧集于一起，界限不清，呈集落型生长，形似鸟巢，集落边缘清晰，折光性强。 (3）可以表达早期胚胎细胞特异表达的基因，如碱性磷酸酶基因(AKP)、高端粒酶基因活性。从基因表达看，ES细胞类似晚期ICM 细胞。 (4）具有无限增殖能力。在适宜条件下，如放在饲养层上或含有分化抑制因子的培养基中，细胞可稳定传代，长期培养。,(5) 广泛的体外分化能力。当在培养环境中去除分化抑制因素或加入诱导分化物时，ES细胞可分化成来自三个胚层的细胞。 (6) 广泛的体内分化能力。将ES细胞接种到同种动物或小鼠体内，可分化产生由多种不同组织组成的畸胎瘤，包括来源于三个胚层的细胞。,(7) 具有种系传递功能。若把ES

12、细胞注射到受体胚胎内，ES细胞可广泛参与胚胎各组织和器官、甚至胚胎生殖细胞的发育，形成种系嵌合体。 (8) 可在体外培养、克隆、冻存及进行遗传操作（如导入基因、标记基因或剔除基因），因此可以通过它制备转基因、基因缺失、突变、过表达的杂合或纯合动物，并可进行各种基因功能分析。,3、 干细胞培养建系技术,3.1 ES细胞的来源 早期胚胎； 从终止妊娠早期的胎儿组织中可分离出多能性干细胞； 体细胞核移植胚胎。（将去核的卵细胞与特定的单个体细胞用电融合法或化学融合法使两细胞相融合，细胞分裂发育并形成胚囊，然后分离内细胞群，获得胚胎干细胞）。,3.2 ES细胞的分离纯化 3.2.1 概念 细胞分离(ce

13、ll isolation)：指将组织材料分散制成组织悬液后，从中获取目的细胞的过程。 细胞纯化(cell purification)：更强调从原代培养前成分混杂的异质性细胞悬液中，或者从培养物中获得单一类型细胞的过程。,3.2.2 ES的分离,全胚培养法 机械剥离培养法 酶学解离培养法 免疫外科法 克隆法,全胚培养法： 将桑椹胚或囊胚直接培养在饲养层上，让其自然脱去透明带，贴壁，与滋养层细胞一起增殖。当ICM增殖垂直向上生长一定时间后，挑出ICM，并离散成小细胞团块，进行继代培养，克隆扩增。,机械分离法采用机械方法除去胚胎滋养层细胞来分离培养ICM。 用吸管或针头捶打;用组织研磨器或注射器研磨

14、;用不锈钢或尼龙筛网搓洗等。 按照组织内部同细胞的大小差异以一定孔径的不锈钢或尼龙筛网过滤细胞起到对细胞进行初步分离纯化的作用。,酶学解离常用的技术 包括用胰蛋白酶及鳌合剂处理、用缓冲液浸泡等。此法主要依据不同组织的细胞和间质的构成不同。,免疫外科法 首先用链霉蛋白酶将胚胎的透明带除去，裸胚在抗体中处理一段时间后，再在补体中作用一段时间，使滋养层细胞发生溶解，然后直接对ICM进行培养与扩增。 免疫外科法可选择性的杀死胚囊外层的滋养层细胞，而仅保留内细胞中的团细胞。,克隆法： 将成纤维细胞或转基因的成纤维细胞注入去核的哺乳动物卵母细胞中，电融合或化学融合并激活，重组胚分裂至桑椹胚或囊胚，分离ES

15、细胞与全胚培养法相同。,以小鼠ES细胞分离为例： （1）将胚泡与兔的抗小鼠的血清共同孵育一段时间； （2）加入补体； （3）在补体作用下外层的滋养层细胞发生溶解（内细胞团细胞不受影响）； （4）胚泡内细胞团在体外适宜的生长条件下形成多种细胞集落； （5）筛选出未分化的细胞集落，培养形成ES细胞系。,3.3 间充质(messenchymal stem cell, MSC)干细胞的分离纯化 差速贴壁法：利用不同细胞贴壁时间不同进行分离的方法（基于不同黏附特性的细胞分离方法），如利用成纤维细胞、星形胶质细胞和成鞘细胞的贴壁时间不同而将它们分离。 如：葡聚糖凝胶G-10常用来分离细胞，其原理即利用细胞

16、的黏附特性，使之黏附于葡聚糖凝胶，从而将异质性细胞悬液中具有黏附能力的细胞去除。 密度梯度离心法：利用不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。,叶锦等(2010),利用密度梯度离心法和差速贴壁法获得了高纯度的肌源性干细胞，并成功扩增。 范萍等(2010),证明贴壁筛选法是理想的体外分离扩增骨髓间充质干细胞(BMSCs)的培养体系，所培养的BMSCs纯度高、生物学性状稳定。 肖宏涛等(2010),利用贴壁法分离了人脐带间充质干细胞。,以CO2窒息法处死大鼠，在无菌条件下取股骨和颈骨，除去骨表面附着组织，用PBS清洗干净； 用骨

17、钳除去股骨近端和颈骨远端，暴露骨髓腔，然后除去骨骺，并用大号针头在骨端的生长面上开一个小孔； 用注射器吸10mL 含血清的培养液，将针头从小孔插入骨髓腔中，注射培养液，从骨的另一端收集冲洗出来的骨髓；,间充质干细胞分离纯化举例： （1）鼠骨髓MSC的分离,将收获的全部骨髓用注射器反复抽吸，以打散组织成为细胞悬液，收集细胞悬液、离心； 用含血清的培养液冲洗悬浮沉淀的细胞，取少量细胞悬液与等量4%乙酸混合溶解红细胞； 计数有核的细胞，计算出细胞悬液中有核细胞的密度，并用含血清的培养液调节细胞密度； 然后将5107个有核细胞接种到直径为10cm的培养皿中，于37、5% CO2、饱和湿度的CO2培养箱

18、中培养。,（2）人骨髓MSC的分离,无菌抽取健康成人骨髓，加肝素抗凝。将肝素抗凝骨髓与等体积PBS混合，用吸管吹打分散细胞； 室温离心弃上清，加入PBS悬浮细胞，调节密度为4107 个mL ；离心管中加入1.073 g/ mL的溶液，再将5mL细胞悬液铺于其上，离心收集界面上的细胞，加入培养液清洗； 离心收集细胞，用培养液重新悬浮细胞并计数，调节细胞密度，接种于培养瓶中，于37、5% CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养； 48h后换液，以后每3-4d换液一次，当培养的细胞相互汇合达到90%的生长表面时，用0.25%胰蛋白酶-0.1% EDTA液消化分散细胞，进行继代培养。,（3）人脐带血MS

19、C的分离,取足月正常生长的胎儿脐带血，加肝素抗凝； 将肝素抗凝脐带血与等体积PBS混合，然后按4：1与0.5%甲基纤维素混合，室温沉降红细胞30min； 小心吸取上层液体，离心、弃上清，用PBS重悬细胞； 在离心管中先加入1.077g/ mL 的溶液，再将5mL细胞悬液铺于其上； 离心，以下步骤同上。,4.干细胞培养方法,饲养层细胞培养法 无饲养层培养法,5.3.1 饲养层细胞培养法,(1)常用的饲养层：小鼠胚胎成纤维细胞、STO细胞。 小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast, MEFs） MEF能抑制胚胎干细胞自主分化、促进胚胎干细胞增殖，故能有效促进胚胎干

20、细胞增殖，并维持其未分化的二倍体状态和全能性。,(2)MEF饲养层细胞的制备 MEF的分离： 将性成熟雌小鼠(78周龄)与种雄鼠(8周龄以上)2：1比例合笼，每天早上 观察雌小鼠生殖道口，有乳白色或淡黄色胶冻状物(阴道栓)即确定为怀孕，见栓当天为怀孕0.5d； 取妊娠12.514.5d的孕鼠,断颈处死后,无菌取出胚胎，洗涤去除残余血迹； 去除胚胎头、四肢、内脏，将躯干剪成1mm3以下的碎块，吸至离心管内； 加入等体积胰蛋白酶 - EDTA消化液，轻轻吹打30次； 细胞离散后,加入等体积MEF培养液，终止胰蛋白酶的消化作用； 8001000r/min离心5min，弃上清液； 加入5mL左右MEF

21、培养液重悬鼠胚组织，制成细胞悬液,记数。,MEF的培养： 原代培养： 调整细胞浓度,接种于培养瓶中培养（一般5个鼠胚可使用1个100-150mL培养瓶），让组织悬液能均匀覆盖培养瓶表面，于37、5%CO2、饱和湿度，孵箱培养。 传代培养： 待成纤维细胞基本铺满培养皿底，用0.25%胰酶和0.04% EDTA消化吹打，置离心管静置5min,取上层液制成单细胞悬液，调整细胞浓度为11062106个/mL（1：3比例），进行传代培养，一般采用35代作饲养细胞用。,MEF饲养层的制备： 方法：丝裂霉素C处理法、线照射法。 一定剂量的丝裂霉素（有丝分裂抑制剂）和射线能够使细胞停止分裂，但又立即死亡，在体

22、外可维持一段存活时间。 可利用其处理饲养层细胞，使饲养层细胞不分裂，又能存活，并分泌抑制ES细胞分化和促进ES细胞增殖的因子，保证ES细胞的生长。,丝裂霉素C法： a. 选取MEF细胞生长旺盛的培养皿,加入有丝分裂抑制剂丝裂霉素C 10g/mL（覆盖细胞单层即可），处理23h； b. 吸去处理液，用PBS标准培养液清洗2-3次,除去残余丝裂霉素C ； c. 用0.25%胰酶、0.04%EDTA消化液消化制成单细胞悬液,细胞计数、调整细胞 浓度为3.0105个/mL； d. 接种到用0.1明胶预处理过的培养瓶或培养皿中。 e. 37、5C02、100湿度孵箱培养，细胞很快贴壁并铺展为单层。这样制

23、成的饲养单层可使用610d，使用前更换成ES培养液，其它细胞饲养层的制备方法基本同于MEF制备方法。,射线处理法: MEF或STO融合成单层后，用射线照射，剂量为30-100Gy，余下步骤同丝裂霉素C处理法(3)(5)，照射过的细胞也可以5106个/mL浓度冻存备用。,（3）小鼠纤维母细胞（STO细胞）培养 STO细胞是SIM小鼠纤维母细胞的一种耐硫代鸟嘌呤（T）和耐鸟苯苷（O）亚系细胞，广泛用作多潜能畸胎瘤细胞和ES细胞的饲养细胞。 主要分泌干细胞生长因子（stem cell growth factor，SCGF）和白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF

24、），抑制干细胞分化。 其代替MEF的优点是：细胞易于生长及不需要经常准备怀孕母鼠，但STO细胞必须保持在最适生长条件下，否则易于变异。 目前已有稳定转染了neor基因和UF基因的STO细胞株(如SNL细胞)，可用于ES细胞的转染和筛选。 STO细胞的培养按一般细胞株的培养方法即可，培养液与MEF相同。,5.3.2 无饲养层培养,（1）基本原理：在细胞培养液中添加ES细胞抑制分化因子，使ES细胞在体外培养环境下保持未分化状态。 (2)培养基的组成 a.常用的基础培养基：DMEM、TCM-199、F-12等。 b.常用的三种ES细胞培养液： 直接在基础培养基中加入重组的LIF-白血病抑制因子，具有

25、抑制胚胎干细胞自主分化的能力。 BRL（Buffalo大鼠肝细胞株）条件培养基-能分泌一种抑制畸胎瘤和胚胎干细胞自主分化的因子。 大鼠心肌条件培养基-能显著促进胚胎干细胞的贴壁和生长。,(3) ES细胞培养中常用添加物 LIF等分化抑制因子 血清 巯基乙醇 非必需氨基酸 核苷酸 亚硒酸钠和其他各种因子等。,(4) ES细胞培养中常用的外源生长因子 表皮生长因子(EGF) 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 干细胞生长因子(SCF) 胰岛素样生长因子(IGF)等。,(5) 培养方法,酶消化法： 待胚胎发育至囊胚或孵化胚后，分离ICM细胞，实体显微镜下挑取形态典型的ICM集落； 用0.25%胰酶和

26、0.04% EDTA消化液消化35min，转入ES细胞培养液中进行剥离ICM细胞； 用孔径适当的吸胚管吹打，制成单细胞或小细胞团块，转入条件培养基中进行培养。,5.4 ES细胞的原代培养和传代培养,5.4.1 ES细胞的原代培养 制备好MEF饲养层并添加相应的ES细胞培养液，隔日将囊胚置入培养； 培养条件:37、5%CO2、饱和湿度。 挑取生长良好，没有分化迹象的ES/EG集落进行消化扩增。用胰蛋白酶消化巢状胚胎干细胞团, 继续培养，一般间隔45d用胰蛋白酶消化成小细胞团块或单细胞，克隆和纯化ES细胞。,5.4.2 ES细胞的传代培养 初次传代后23d后将会出现小的ES细胞集落，待ES细胞集落

27、充分增殖而不出现分化时重新离散，转入新鲜饲养层上。 经数次分离纯化后，ES细胞逐渐扩增，每隔46d传代一次。 对ESEG细胞进行消化传代总的原则是：尽量缩短酶消化作用时间，将细胞的损伤降到最低程度，且能将集落消化成小细胞团块。,人胚胎干细胞（ES细胞）系的建立,5.4.3 ES 细胞的冷冻与解冻,在ES细胞传代过程中，需要不断对细胞进行冷存。因为ES细胞的耐受性差，应采用“慢冻-快溶” 的方法，即冷冻时不宜过快，以保持ES细胞解冻后最大的存活率。,取材处理： 取对数生长期的ES单细胞悬浮液放入冷冻液中。 冷冻液： 75% DMEM+15%新生牛血清(NCS)+10% DMSO（用时配制） 冷冻

28、： 冷冻开始温度下降速度保持在13min为宜，当温度下降到20左右时，下降速度可调为5min，到100左右时，可迅速投入液氮中。 解冻： 从液氮中取出冷冻管，投入37水浴至全部溶解，70的酒精消毒冷冻管外壁，立即加入ES细胞培养液，离心2次除去冷冻液，弃去上清，以培养液重新悬浮细胞，然后再放入CO2培养箱培养。,5.5 ES和EG细胞系的特性和鉴定,5.5.1 ES/EG细胞系的特性 ES/EG细胞具有在体外无限或较长期增殖和多向分化的潜能，能实现体外外源基因的导入和细胞嵌合，成为组织工程的一种理想种子细胞。ES/EG细胞系的特性如下： （1）无限增殖性 在不分化前提下，ES细胞体外培养增殖迅

29、速，每1824h增殖一次，细胞随着增殖次数的增加而活力并不减弱，增殖过程中细胞大多处于S期，进行DNA合成。,（2）分化潜能性 高分化潜能： 具有高度分化潜能，可分化形成包括三个胚层在内的各种类型细胞（血细胞、内皮细胞、肌细胞和神经细胞等）。 定向分化： ES细胞在体外某些物质诱导下可以发生定向分化，如用造血基质细胞、不同造血生长因子对单层培养的ES细胞进行诱导分化，可形成各阶段的造血细胞。,（3）种系传递性 将ES细胞注入囊胚后发育，可获得嵌合体，并参与生殖细胞的形成。 在嵌合体中一部分组织和细胞来源于受体囊胚细胞，而另一部分来源于ES细胞。基于其种系传递特性，可在ES细胞水平进行基因打靶等

30、操作，研究基因在个体发育中的作用。,5.5.2 ES/EG细胞的鉴定,ES/EG细胞经分离培养，最终建立细胞系，需要根据其细胞特性进行一系列鉴定，以了解是否分化变异、干细胞的特性或能力是否丧失。 ES细胞的鉴定方法： 形态学特征； 特异性标志分子的表达； 分化潜能测定。,（1） 形态学特征 细胞特征： ES细胞与早期胚胎相似，细胞体积小，核质比高，细胞核大，有一个或多个核仁，染色体正常，具有稳定的二倍体核型，染色质较分散，细胞呈多层集落状生长，无明显细胞界限，形似鸟巢，边缘整齐，折光性强。 不同ES细胞形态不同，鼠ES细胞集落一般呈紧密的球形，灵长类动物的ES细胞集落相对较为扁平。,（2）细胞

31、表面标志鉴定, Oct4基因表达： Oct4基因是小鼠胚胎发育早期生殖细胞系以及体外培养的多能干细胞特异表达的一种发育多能性的标志基因，是一个和发育全能/多能性相关的转录因子。 可用Oct4抗血清和间接免疫荧光法检测ES细胞中Oct4基因的表达产物，分化细胞不表达该基因，可鉴定胚胎性干细胞是否处于未分化状态。 Oct4最早表达于8细胞时期，在每个卵裂球中都可检测到大量Oct4表达产物；囊胚期后， Oct4的表达局限于内细胞团细胞，而滋养外胚层和原始内胚层均为阴性；到原肠形成后，胚胎内唯一能检测到的Oct4表达的是原始生殖细胞。, 碱性磷酸酶检测（alkaline phosphatase ，AK

32、P）：未分化的ES细胞表面标记AKP呈强阳性，细胞一旦分化，则AKP呈阴性。 阶段特异性胚胎细胞表面抗原（ stage-specific embryonic antigen， SSEA）：SSEA是一种糖蛋白，在未分化多能干细胞中SSEA为阳性，反之呈阴性。 其他表面标志分子，如TRA-1-60，TRA-1-81，GCTM-a，干细胞因子和生殖细胞核因子等。,举例：胚胎阶段特异性细胞表面抗原（SSEA）的检测,鼠和人ESC表达的表面抗原具有种属差异性。 小鼠胚胎内细胞团细胞、ESC和EC表达SSEA-1，但不表达SSEA-3和SSEA-4。 人ESC表达一些标志未分化态特征的细胞表面抗原，包括

33、早期胚胎特异性抗原SSEA-、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81，但不表达SSEA-1。其中SSEA-4一直呈强阳性，SSEA-3为弱阳性；已分化的ESC的SSEA-1表达呈强阳性。,体外诱导分化14 d的cripto ES细胞 用anti -tubulin抗体免疫荧光染色分析显示 ES细胞分化成神经细胞（引自Kursad Turksen. Embryonic Stem Cell Protocols（2nd），2006）,人原始生殖嵴细胞（PGC）分离的EGC的SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81均表现为阳性。 家兔SSEA-1的表达与小鼠

34、的基本相似，桑椹胚卵裂球和早期囊胚细胞呈阳性，晚期囊胚中部分呈阳性，部分呈弱阳性，少部分呈阴性。因此，常用SSEA-1单克隆抗体来检测ESC。,马ES细胞的分子标记表达（引自Kursad Turksen.Embryonic Stem Cell Protocols（2nd），2006） 图A：ES细胞AKP染色阳性 B：大部分ES细胞 STAT3特异性抗体免疫组化染色阳性,小鼠ES细胞检测,核型的检测,使胚胎干细胞保证正常的核型非常重要，只有具有正常核型的胚胎干细胞才能嵌合到宿主着床前胚胎内，共同分化发育成嵌合体动物； 为了进一步鉴定，还可以染色体带型分析。,染色体联会复合体的分析,（3）分化能

35、力检测,体外分化实验 将所得细胞制成悬液培养在培养皿中，如所得细胞为ESC，则在培养过程中部分细胞聚集贴壁，培养一段时间后将分化为神经、肌肉、软骨等不同组织细胞，同时还有部分细胞悬浮生长，先形成简单类胚体，进一步形成囊状胚体。根据ES细胞分化程度不同，可初步了解其分化能力的强弱,体内分化实验 以一定量所得细胞腹股沟接种或腹腔注射到同源动物或免疫缺陷小鼠体内,若为ESC，经过一段时间后，动物注射处可见有组织瘤生成。手术取瘤，常规制作切片观察，可见代表内胚层、中胚层和外胚层个胚层的不同组织细胞。,体外分化实验,体内分化实验,（4）嵌合体的形成,利用囊胚注射法，应用显微注射仪将ES细胞注射到受体囊胚

36、腔，使其与正常胚胎结合在一起，再移植到假孕母鼠子宫腔（胚胎移植），使之发育成个体。 如果ES细胞具嵌合能力，则会融合到宿主胚胎细胞中，并共同分化发育成各种组织细胞，并产生嵌合体小鼠，嵌合体动物可以通过皮毛颜色、蛋白质、DNA 指纹、同工酶等进行检测。 而ES细胞一旦分化即丧失全能性，便难以参与胚胎发育形成嵌合体。,NT,ES,Tetra-clone,Differentiation,Donor,5.6 ES/EG细胞体外诱导分化,5.6.1 ES/EG 细胞维持未分化的分子机制 (1)维持ES细胞未分化关键因子 LIF/STAT3通路(signal transducers and activat

37、ors of transcrption):通过复合物gp130磷酸化效应分子的酪氨酸残基，将信息传至细胞核内相应的靶基因上，而使细胞处于高度增殖状态。 转录因子Oct-4/3： 可使ES细胞维持未分化状态。,（1） LIF/STAT3通路 LIF是通过与细胞表面的受体结合而发挥其生物学效应。LIF受体(LIFR)广泛分布在体细胞上，是一种分子量为250KDa的糖蛋白，LIF与其受体结合后，可激活结合于gp130胞内近膜部分的JKA激酶，活化的JKA激酶催化gp130胞浆区的酪氨酸磷酸化，进而激活转录因子STAT，活化的STAT形成同源二聚体并移向核内，与核内特异的靶细胞基因位点结合,并激活ST

38、AT1与STAT3，STAT3是维持ES细胞不分化状态的决定性因子，被激活后就足以抑制ES细胞的分化。,（2）Oct-4,Oct-4基因表达上调2倍可使ES细胞分化为原始内胚层细胞； 表达程度不变可维持ES细胞未分化状态； 表达下调可使ES细胞分化为滋养层细胞。 在ES细胞发生自发分化的过程中，仍有一定水平的Oct-4表达。说明Oct-4基因的表达是维持ES细胞未分化状态的必要条件，但不是充分条件，还需LIF等其它因子的协同作用。通过对这些信号途径的研究，发现只有这些因子处于一种特定的平衡状态时，ES细胞才会保持一种未分化的自我更新状态，一旦平衡移动了，ES细胞就会开始分化。,干细胞在体外培养

39、需要抑制其分化，目前在体外维持胚胎性干细胞自我更新的常用手段： （1）使用饲养层细胞（STO、MEF） （2）条件培养基（对数生长期细胞分泌到培养基中的物质，如生长因子中的LIF、白介素-6、制瘤素M、睫状神经营养因子等）， （3）直接加入抑制分化的细胞因子，如白血病抑制因子等。,5.6.2 ES细胞体外分化的基本原理,分化模式：自发分化、诱导分化、基因调控分化。 （1）自发分化 是指ES/EG细胞在体外呈单细胞悬浮培养时，会形成由多种类型细胞组合的类胚体，在加入生长因子干预后能够增加某一类型细胞的相对数量。如形成有搏动功能的心肌细胞，这些细胞具有胎儿心肌细胞的特性。,（2）诱导分化 将ES细

40、胞与不同类型的细胞共培养或添加相应的分化诱导因子，可使ES细胞朝特定的方向分化。 分化诱导剂：视黄酸(retinoic acid，RA)、DMSO、3-甲氧苯丙胺、神经生长因子等。 例如： 骨髓基质细胞或OP9细胞可诱导ES细胞向造血干细胞分化； PA6细胞可促进ES细胞向神经细胞分化； DMSO和丁酸钠可依次诱导ES细胞形成肝细胞。,（3）基因调控分化,基因调控分化强化或抑制某些基因表达，形成单一谱系所特有的基因表达方式，定向诱导ES细胞的分化。 例如： 将TAT PDX1融合蛋白转入hES细胞，激活下游靶基因的表达，可促进干细胞胰岛素分泌，有助于干细胞向胰岛细胞的分化。,5.6.3 体外诱

41、导分化的方法,基因外诱导（epigenetic manipulation） 基因修饰（genetic methods）,（1）基因外诱导 在细胞水平上对ES细胞进行诱导分化。 包括： 诱导剂法 序贯诱导法 特殊诱导法,a、诱导剂法 诱导剂视黄酸（RA），常用于诱导神经细胞分化。 诱导机制通过ES细胞结合于RA受体，受体与目的基因的DNA结合域结合，激活神经相关基因，从而促进神经的分化。,RA诱导程序：,b、序贯诱导法,序贯诱导法模仿体内胚胎细胞生长和分化的环境，按ES细胞生长阶段，逐步改变培养液成分及血清浓度，添加生长因子和神经营养因子等，诱导ES细胞向神经细胞定向分化。,“五步序贯诱导法”,

42、第一步：扩增未分化的胚胎干细胞； 第二步：去除促有丝分裂素或分化抑制剂，悬浮生长，逐渐形成类似体内发育的胚体EBs； 第三步：去除生长因子，选择巢蛋白(nestin)阳性细胞； 第四步：使用神经细胞培养液，添加生长激素、神经营养因子，扩增神经前体细胞； 第五步：利用促神经元存活因子(SPF)诱导，并维持神经元成熟。,体外诱导分化14 d的cripto ES细胞 用anti -tubulin抗体免疫荧光染色分析显示 ES细胞分化成神经细胞（引自Kursad Turksen. Embryonic Stem Cell Protocols（2nd），2006）,c、直接分化法,将ES细胞在饲养层细胞上

43、高密度延长培养； 用神经细胞培养液培养，ES细胞自发分化为神经样细胞； 使用无血清神经细胞培养液让ES细胞过度生长； 在细胞集落中央可获得高纯度的原始神经上皮，进而得到大量神经细胞。 分化机制： 可能是通过神经分化内定模式(Default Model)发生，即外胚层细胞可在无外界信号诱导下自发分化为神经细胞。,（2）基因修饰,方法: 将一个特异性基因通过病毒载体转染入ES细胞，即可得到高纯度的特定类型细胞。 例如： Nestin是一种较常用的神经前体细胞标志蛋白，将它与报告基因-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)共同转染ES细胞，经过筛选纯化，得到神经前体细胞。, 向ES细胞导入一段增殖基因(pr

44、opagating gene)，该基因表达后调控ES细胞其它基因的表达，促进其分化，从而实现ES细胞的定向分化。 例如： 将促“多巴胺能神经元”生成的转录因子Nurrl通过质粒转入mES细胞系，建立Nurrl ES细胞系诱导后得到50%多巴胺能神经元。 利用小分子RNA( siRNA)来抑制细胞在分化或增殖过程中的特定基因表达，从另一方面实现对该基因的细胞修饰。 例如： 表达siRNA基因的逆转录病毒，可以使OCT2-4和Nanog基因沉默。,优点及存在问题：,优点：能快速、方便的直接进行细胞诱导。 问题： 如何有效地提高基因转染率； 探讨各个基因在ES细胞中的调控作用仍处于初步研究阶段； E

45、S细胞的基因治疗还仅应用于实验动物模型； 应继续进行动物实验，不断为ES细胞培养及诱导方法提供新方案、新理论； 对诱导的ES细胞进行严格鉴定及体内实验，使其能够尽早进入临床试验。,6.干细胞研究意义,干细胞研究几乎涉及生命科学及生物医药的所有领域，除了对细胞治疗、组织器官移植、基因治疗具有重要作用外，还将对新基因的发现、基因功能分析、新药开发、药效与药物毒性评估等领域产生重要影响。,其意义主要表现在以下几个方面：,(1)为临床多种疑难病的治疗带来希望； (2)为组织工程提供取之不尽、用之不竭的原料； (3)为探讨哺乳动物早期胚胎发育的机制提供模型； (4)为研究与发育相关的基因的功能提供良好的

46、模型； (5)提供更为便捷的转基因动物方案； (6)在发现新基因、基因功能分析方面有重要意义； (7)对新药开发、药效与药物毒性评估等领域产生重要的影响。,7. 干细胞的应用前景,随着干细胞技术和理论的发展，产生了一门新的学科分支再生医学。它是一门使用多种修复技术手段使人体的组织器官功能得以改善或恢复的新兴学科，其中基因治疗和细胞治疗是重要的组成部分。 若能成功诱导和调控体外培养的ES细胞进行定向分化，将对研究新基因的表达特性和生理功能发挥重要作用，同时使得用移植干细胞来治疗各种疑难疾病，甚至在实验室内生产各种组织器官成为可能。,7.1 干细胞与临床治疗,ES细胞具有自我更新能力，且能在体外增

47、殖和分化过程中保持基因组DNA的稳定性，是目前理想的基因治疗载体细胞。 很多疾病，特别是采用其他方法无法治疗的疾病，可以通过干细胞而治愈。这些严重的疾病包括帕金森氏病、糖尿病、慢性心脏病、晚期肾病、肝病、神经系统疾病、感染性疾病研究、风湿性关节炎，基因治疗、癌症等。ES细胞是细胞治疗的良好靶细胞。,将目的基因导入ES细胞，使基因的整合数目、位点、表达程度和插入基因的稳定性及筛选工作都在细胞水平进行，保证了基因治疗的安全性与有效性。 例如: 如果发现早期胚胎有某种基因缺陷而会患基因缺陷病囊性纤维化，可以收集部分或全部ES细胞，通过基因工程技术用正常的基因替代干细胞中的缺陷基因，再将修复后的胚胎干

48、细胞嵌入胚胎中，经过妊娠将会产生一个健康的后代。,向小鼠受损心脏移植胚胎心肌细胞（embryonic cardiac-muscle cells），成功地使其恢复了功能，这意味着干细胞治疗技术可以治愈人类受损心脏。 通过同源重组，改变ES细胞的MHC基因结构，或用受体的MHC基因置换ES细胞的MHC分子，建立适合不同个体移植的通用ES细胞系，从而消除ES细胞免疫源性。,7.2 建立哺乳类动物发育的体外模型,（1）ES/EG细胞系为哺乳类动物胚胎早期发育和细胞分化的研究提供了充分的材料来源。ES细胞悬浮生长时可得到类胚体，成为早期胚胎发育分化的体外模型。 （2）在特定的体外培养条件和诱导剂的共同作

49、用下，ES细胞在体外可被诱导分化为属于三个胚层谱系的各种高度分化的体细胞，是研究某些前体细胞起源和细胞谱系演变的理想实验体系。,（3）通过对培育出的大量胚胎发育过程中不同时期细胞基因表达的研究，有望认识胚胎早期发育或畸胎发生的机制。 （4）可以利用同源重组或基因打靶技术使ES细胞的某些基因发生突变，对在胚胎发育中起作用的基因进行分析，这样不仅可以了解早期胚胎发育中某些基因的功能，而且可以利用ES细胞的分化调节基因及表达产物来研究细胞的定向分化，分离克隆出在胚胎发育中起重要作用的基因。 （5）将特定基因功能去除的ES细胞注入正常发育的胚泡，发育为嵌合体，可在整体水平上研究该基因的功能。,7.3

50、制备克隆动物和转基因动物的绝好材料,利用ES细胞生产嵌合体动物，是检测ES细胞全能性，生产转基因动物的主要方法之一。 将一定数量的转基因ES细胞注射入囊胚，可生产转基因嵌合体。因为动物ES细胞具有多能性，并可以在体外增殖、冷冻，因此是生产转基因克隆动物的理想材料。,利用ES细胞生产转基因动物的优点: （1）在生产转基因动物以前，通过研究在体外ES细胞系中外源DNA表达质粒的构建、整合和表达，从而可提高转基因动物的效率； （2）ES细胞增殖迅速，可作为取之不尽的供体细胞来源； （3）ES细胞的体外操作技术相对容易，如敲除、敲入，改造特殊基因，能克服插入失活和特殊内源性基因失活等缺点； （4）用E

51、S细胞来生产转基因动物突破了物种的界限，突破了亲缘关系的限制，大大加快了动物群体遗传变异程度。,7.4 作为新药开发的工具细胞,干细胞为药物筛选提供了极好的模型。 首先，干细胞可无限增殖，获得大量的细胞，并能分化为具各种功能的特化细胞，为新药药效、毒性、药理、药物代谢、药物动力学、耐药性等的检测提供了细胞水平的研究手段。 例如：诱导干细胞分化为胰岛细胞或用胰腺干细胞诱导分化为胰腺细胞，可以用来筛选糖尿病的治疗药物； 将神经干细胞分化为神经细胞，用以筛选治疗神经系统疾病如老年性痴呆、帕金森氏病等疾病的药物。 利用干细胞进行药物筛选可大大提高效率，降低成本。,此外，通过克隆的方式将一些细胞因子(如干扰素、促红细胞生成家、抗凝血酯等)的基因导入干细胞，然后制备转基因动物，最后从动物的体液或组织