军团菌及其检测方法.ppt

1、军团菌及其检测技术,武汉市疾病预防控制中心 微生物检验科 赵滢 博士 Email： 2014年11月,军团菌的发现,1976年7月在美国费城，参加退伍军人大会的人员中爆发了一种症状相同，原因不明的细菌性肺炎， 有221人感染疾病，其中死亡34人。 初步的流行病学分析显示，致病的微生物可能通过空气传播，采集标本，分离病原体 革兰氏阴性杆菌嗜肺军团菌（L. pneumophila ） 军团菌病 (已知的首次爆发),Part I：军团菌及军团菌病,军团菌,革兰阴性杆菌,浅红色的短杆菌，直径0.30.5m，长约1.25m或更长，菌体一端有鞭毛. 在含L-半胱氨酸和焦磷酸铁的BCYE琼脂培养基上生长，通

2、常需要在37 5%CO2培养箱培养2-10天。 生长形成的菌落一般呈白色，也可能会从紫色变为蓝色，或是灰绿色。,初步在BCYE琼脂培养基上生长的菌落为刻花玻璃样，具有多型性.,军团菌科、属、种、血清型,军团菌科 (Legionellaceae ） Legionella / Fluoribacter bozemanii / Tatlockia micdadei 军团菌属：16s rRNA分析表明，在蛋白细菌系亚群中，军团菌科只有一个军团菌亚群。与引起Q热病的coxiella burneti(贝氏克斯体）亲缘关系最近，二者具有同样的细胞内生活方式，可以利用共同的基因感染宿主细胞。 军团菌种：现已发

3、现50个种（species），70多个血清型（serogroups)，至少有20个种可引起人感染。,军团菌种,军团菌病,Part II：样本的采集与运输,哪些环境中存在军团菌？,标本的种类,环境水标本：空调冷却塔水、冷凝水,温泉水,淋浴水, 加湿器水； 病人组织标本:如痰,支气管灌洗液,胸水,血液等标本。,环境标本采集原则,最初流出的水标本：打开水龙头或装置后立即采集水样，该水样即代表设备内的水。 过后流出的水标本：最初流出的水标本收集以后，让设备内的水流掉后再采集水样。此水代表供给设备的水。,环境标本采集,有杀生物剂时的采样：水样中含有氯或其它氧化性杀生物剂时，向采样瓶中添加适量硫代硫酸钾使

4、其灭活。对于其它的生物剂，加入普通的中性试剂是无效的。 注意：样本采集到浓缩，以及样本采集到浓缩培养的间隔时间控制在14天以内。样本的来源，数量，有无杀虫剂都要登记，并同标本一起送到实验室。不知来源或不知道处理过程的水标本是不予进行试验的。,常见几种系统采集部位,冷水系统的采集： 进水系统 蓄水池 与每个蓄水池相连的下水道的排出口 蓄水池最远的下水道的排出口 对每一个装置来说，收集500ML最初流出的水标本，让水持续流，并在流水中放一只温度计，待温度稳定后，收集500ML过后流出的水标本。,热水系统 加热器的排出口：选用保护性的橡胶手套和其它的保护性装备 关掉离加热器最近的冷水系统。 避免冷热

5、水混合 加热器的排水口可用火焰或酒精棉球消毒干燥 排水口连接一根干净的硅胶管 采样方式：打开开关采集最初流出的水标本。让水排掉至温度稳定为止。再采一份过后流出的标本，并关闭开关,淋浴器,收集最初流出的水标本 如果淋浴器有一个大的莲蓬头式喷嘴，用一个干净的未用过的塑料袋，该装置包裹起来，切掉一个角，将该切口处置于接取标本容器的开口处,冷却塔,警告：为安全起见，采样前，负责供水系统的工作人员应关掉冷却塔的鼓风机。戴一副齐肘的橡胶手套，从池内舀水，由于机器继续运行而不能关闭冷却塔时，则需要采样人员做出专门的安排，这种情况下，应佩戴安全护目镜和呼吸道防护装备。 在塔的入口处采样：将干净的硅胶管插入瓶内

6、，通过虹吸作用吸取顶部蓄水池的水。先用水充满管子并夹住其一端，以防止管子空了。管的一端放在蓄水池里，另一端放在采样瓶里，使瓶内管的一端低于蓄水池管的一端。松开夹子，水开始流出，取够所需的量，停止虹吸，将管从蓄水池内取出。,进水口远处采集池塘内的水：用勺子采取冷却塔，池塘表浅部位的粘泥（深度20cm)，用虹吸管采取池子深处的粘泥。采集位于该系统内滤器的水，沉淀物，碎砾等。 注意：所需样品的数量取决于该系统内的大小和地理位置。如果蓄水池和水塔之间的管道短，那么只需采集一份标本。,标本的运输和相关生物安全要求,在周围环境温度下运送水样标本,不必冷冻,但要防止受热和阳光,标本要尽可能快或最好在两天内送

7、到实验室,室温下(21+3)贮藏在实验室或其他地方。 对于临床标本，最好立即做预期实验，如不能马上进行，应放在-20冻存备用。,军团菌操作生物安全性,应用的试剂须符合有毒物质操作要求和相关规定。 生物安全级实验室，最好在安全柜中操作。 操作人员培训。 菌种保存。,可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定,Part III：军团菌的分离与检测,水样标本中军团菌的分离方法,检测依据: 公共场所集中空调通风系统卫生规范中的集中空调通风系统冷却水、冷凝水中嗜肺军团菌的检验方法见附录B。 适用于各种环境标本军团菌检测 ，包括： 饮用水、工业用水、天然水以及一些如沉积物、沉淀物、软泥等物

8、质。,标本,肺组织、支气管灌洗液、血液、痰、胸水、胸腔引流物,水样,血清,水样处理与制备,血清学检测方法： *间接荧光抗体染色法 *试管凝集试验 *ELISA法,接种军团菌BCYE培养基,接种军团菌选择性GVPC培养基,37，5%CO2，培养3-14天,挑可疑菌落革兰氏染色涂片镜检,37,5%CO2,培养3-14天,革兰氏染色阴性杆菌,革兰氏染色阳性杆菌,纯培养,弃去,确认试验,血清玻片凝集试验,PCR检测,生化试验,尿液,抗原 检测,军团菌水质检测概括,采样 浓缩 培养 分离 鉴定,实验所需仪器设备,90mm平皿 3537孵箱 滤器（大的不锈钢制成的滤器） 正压膜蠕动过滤泵：流速可调。3升/

9、分钟 注意：样本量少，也可用真空辅助的滤过系统代替 膜滤器：0.22um或0.45um 水浴锅： 离心机： 涡旋振荡器： 显微镜：,军团菌检测所需准备基本试剂,培养基（GVPC，BCYE,BCYE-CYS) 试剂 (生化试剂、甲醛的盐溶液） 酸缓冲液（0.2mol/L KCL-HCL)，碱缓冲液（0.03mol/L KOH） 血清学试剂,培养检测所需准备材料,直径大约为90mm或100mm的无菌培养皿 培养箱，CO2能够恒温保持在（361）。 水浴箱，能够保持在（501） 显微镜或荧光显微镜。,样品采样准备材料,玻璃、聚乙烯或类似的容器瓶：灭菌处理。水样一般采集为250-500ml，收集在容器

10、瓶中。 如果所用的容器，如聚乙烯瓶，不能高压，可用流动的热水（不低于70）或蒸汽进行巴斯德氏消毒，时间不低于5分钟。 小的无菌容器瓶：可用来收集淤泥、沉淀物或沉积物。 广口的容器：用来收集淤泥等，要有螺丝盖。 灭菌棉拭子。 一般建议用塑料包装的容器,军团菌培养基,Muller-Hinton琼脂,第一次分离出嗜肺军团菌使用的培养基,活性炭酵母抽提物琼脂，活性炭替代培了淀粉以去除培养基的毒性，并且氨基酸也逐渐被酵母抽提物替代,CYE琼脂,CYE琼脂加入-酮戊二酸,BCYE琼脂,BCYE琼脂中含有选择性抗生素,GVPC琼脂,军团菌培养基,军团菌分离培养用BCYE培养基,酵母浸出物10.0g 活性炭2

11、.0g 琼脂17.0g 酮戊二酸1.0g 蒸馏水950 mL 半胱氨酸盐酸盐0.4g 可溶的焦磷酸铁0.25g,半胱氨酸和焦磷酸铁分别溶于10 mL蒸馏水，分别过滤（0.45m滤器）。将 剩余培养基成分溶于950 mL蒸馏水，高压灭菌。水浴冷却至50，加入上述过滤 液。10 N KOH调整pH至6.9。蒸馏水补充至1L。 倒培养基前先摇动混匀以保持碳呈悬浮状态。每平板20ml （15100mm），斜 面10ml或4ml（20150mm或13100mm）。,ACES缓冲液(2乙酰基2氨基乙烷磺酸) 10.0g,选择性（GVPC）培养基的制备,添加四种抗生素： 甘氨酸3g/L（稳定剂，防腐剂，缓冲

12、剂） 多粘菌素B（硫酸盐）79200iu/L（抑制大肠肺克，百日咳等） 万古霉素（盐酸盐） 0.001g/L（金葡，化脓性链球菌，白喉，肺链，炭疽等） 放线菌酮0.08g/L（杀真菌，致畸，）那他霉素也可代替之。,抗生素的配制,多粘菌素B：200mg加入100蒸馏水中，混匀后，.uM滤器过滤除菌，以5.5量分装到无菌瓶内，冷冻保存。用时在室温下孵化。 万古霉素：20mg加入20蒸馏水中，混匀后.uM滤器过滤除菌，以ML量分装到无菌瓶内，冷冻保存。用时在室温下孵化。 放线菌酮：2g加入100蒸馏水中，混匀后，.uM滤器过滤除菌，以4 ML量分装到无菌瓶内，冷冻保存。用时在室温下孵化。 注意：放线

13、菌酮具有肝毒性，当处理这种粉末状试剂时，应该带手套和防尘口罩。,GVPC培养基的制备,按上述BCYE培养基的方法配制完成后，冷却至50 C时，分别添加已配制好的三种抗生素。每种取一份剂量，充分混匀后即为最终选择性培养基。,BCYE-Cys培养基,为不含L-半胱氨酸的酵母浸出物、炭粉培养基。按照配制BCYE培养基的方法配制，不加L-半胱氨酸。,半成品培养基,培养基的质控,注意：消毒过程中，加热时间过长或温度过高，都能影响培养基的营养质量。培养基成分每批间的差别（特别是酮戊二酸）也能影响其效能。所以，检验各批次新配制的培养基是十分必要的。孵育三天，观察其支持军团菌的能力来判断。 选择新鲜培养的LP

14、1型参考菌株和分离到的LP1菌株（勿超过10代）制成菌悬液，分别接种到新旧两个批次的培养基上。孵育之后记录和比较结果，确保其菌落形态和菌落数量是相同的。,水样的正压膜过滤法,安放滤膜； 过滤； 取膜； 洗膜。,水样浓缩物的贮存,最好对样品立刻进行分析； 标本于（62）储藏最多不超过15天。 对于军团菌来说，如果储藏于06，这种损失是最明显的。而且，温度在20或20以上时，异养生物的生长速度就会变快。,两种处理方法,热处理：将浓缩好的样品混匀后分别取1ml 于无菌管中，放到50度水浴内保温30分钟； 酸处理: 取适量浓缩好的样品混匀后离心，6000rpm10分钟。灭菌管吸去上清，至原来一半的量。

15、再次重悬混匀，加入酸缓冲液至原来的量，并轻轻混匀，室温下静置5分钟，备用。,选择培养基的接种,将100ul浓缩好的但未经任何处理的标本接种到GVPC平板上，用无菌接种环将液体均匀涂布在整个培养基表面。 用同样的方法，从水浴中取出热处理的标本，吸取100ul接种到GVPC平板上。 同样，经酸处理的立即接种。,接种标本培养,接种过的培养基静置直至接种物被完全吸收，然后将平板倒置，在（361）培养7-10天。 为了保证培养箱内的空气的湿度，可以在培养箱内放置一个盛水的碟子。在每次观察培养物时，向碟子内注满新鲜的水（根据需要）。 在含2.5-5.0% CO2的环境下培养有利于军团菌的生长。,平板的检查

16、,培养时间内，48小时后，每天观察菌落生长情况。 军团菌菌落通常呈灰白，灰绿，紫色和蓝色。表面光滑，边缘整齐。一种的菌落（博杰曼军团菌，高曼，杜莫夫等）能自动发出白色耀眼的荧光。,孵育不同时间菌落生长情况,军团菌菌落特点（1）,军团军菌落通常呈灰白色，但也能呈蓝色、灰绿色、深褐色或深红色。 一般表面光滑湿润，边缘完整，并显示典型的毛玻璃样外观。 在紫外灯下，某些种的菌落（博杰曼军团菌、高曼军团菌、杜莫夫军团菌、安绥军团菌、奇锐军团菌、斯泰戈瓦尔特军团菌、格瑞梯纳军团菌、图森军团菌、巴黎军团菌）能自动发出白色的耀眼荧光；某些种的军团菌也能发出红光。,军团菌菌落特点（2）,嗜肺军团菌的菌落呈暗淡的

17、绿色，并常伴有浅黄色。 为了避免军团菌被杀死，平板暴露于紫外灯下不能超过规定时间。 值得注意的是，新发现的某些种的军团菌所具有的特征可能会和上述特征有所区别。,可疑军团菌菌落的进一步鉴定,BCYE或其他培养基上传代培养 革兰染色镜检 生化鉴定 PCR检测军团菌特异性基因片段 免疫荧光的方法确定军团菌的种类,BCYE或其他培养基上传代培养（1）,至少从每块GVPC平板上挑选出两个典型的军团菌菌落，在BCYE和BCYE-Cys培养基上传代培养，传代培养要在两种培养基上同时进行。 在（361）至少培养两天。 凡是在BCYE培养基上生长而在BCYE-Cys培养基上不生长的菌落即可初步认定为军团菌。,B

18、CYE或其他培养基上传代培养（2）,营养琼脂或血琼脂培养基可以代替BCYE-Cys培养基。如果在这三种培养基上都不生长，原来选择性培养基上的可疑军团菌菌落应该继续传代培养。 橡树岭军团菌和幽灵湖军团菌在初次分离培养时需要L-半胱氨酸和铁离子，但随后在L-半胱氨酸缺失时生长微弱。,BCYE培养基上传代培养,BCYE,血平板,BCYE不含半胱氨酸,革兰染色镜检,军团菌是革兰染色阴性，浅红色的短杆菌，直径0.30.5m，长约1.25m或更长，菌体一端有鞭毛，长时间培养后鞭毛可能变成长丝状。,短杆状,长丝状,军团菌生化鉴定,确定军团菌的种型,Oxoid 的乳胶试剂盒可以鉴定出： 嗜肺军团菌血清1型;

19、嗜肺军团菌血清2-14混合型； L. longbeachae1和2型 ，L. bozemanii1和2型，L. dumoffii，L. gormanii，L. jordanis，L. micdadei， L. anisa混合型。,确定军团菌的种型-1,在进行鉴定试验前，要保证在BCYE培养基上生长的菌落是经过形态学检查的纯菌。 属的鉴定，16sRNA。,嗜肺军团菌的确定,应进行生化培养与血清学实验确定嗜肺军团菌。有条件的可做嗜肺军团菌特异的PCR检测。 生化培养：氧化酶（/弱+），硝酸盐还原，尿素酶，明胶液化，水解马尿酸,淀粉酶水解弱+ 血清学实验：用嗜肺军团菌诊断血清进行分型。 PCR：mi