二氢卟吩e6的制备及其性质的研究

1、二氮吓吩e6的制备及其件质的研究二氢口卜吩e6的制备及其性质的研究专业：物理化学 申请者：郝建冬 导师：罗一帆教授二氢吓吩e6及其复合物具有良好的光谱特性，且无毒，对肿瘤具有选择性, 在正常组织中代谢较快等优点，可作为新型光敏剂应用于声动力治疗恶性肿瘤的 方法中。但目前存在着二氢吓吩c6的合成方法不明确、分离纯化方法不理想等 缺点，限制了其应用。本文论针对二氢吓吩e6的合成方法及分离纯化方法问题 进行了进一步的研究，首先建立二氢吓吩e6的HPLC方法；并对得到的粗品进 行分离纯化方法的摸索研究；同时研究了二氢吓吩e6及其复合物的光谱特性， 并对荷瘤鼠进行了荧光诊断试验研究。结果如F：（1）以色

2、谱柱PLATISIL ODS 5/zw 250mmx4.6mm对二氢卩卜吩e6进行高效 液相色谱法（HPLC）检测研究。得到二氢吓吩e6的高效液相色谱法（HPLC） 检测的最佳色谱条件：流动相为甲醇：水（含0.1% 0. Imol/L醋酸饮醋酸缓冲 溶液，pH 3.4）,梯度洗脱：甲醉的比例由80%升至100%,水的比例由20%降至 0%,洗脱时间40min；检测波长400nm；流速l.Oml/min,柱温25*0。（2）采用HPLC方法对二氢吓吩e6的合成条件进行了摸索与探讨。得到二 氢吓吩e6合成的最佳条件：反应体系需隔绝氧气，并通入氮气，于回流 25min,调节pH至5-6,得到的二氢口

3、卜吩e6纯度较高、产率较大。（3）采用溶剂萃取法和柱分离方法对二氢口卜吩e6粗品进行分离提纯研究， 并在HPLC条件建立的基础上对其纯化产物进行检测，筛选出最佳的萃取溶剂 LF,和最佳柱填料.铁盐，使二氢吓吩e6纯度到达92%o（4）对二氢口卜吩e6复合物进行紫外可见光光谱物扫描研究，发现二氢吓 吩c6复合物在600nm-700nm Z间存在两个吸收峰，且短波处吸收峰峰值大于长 波处的复合物具有较好的光敏特性。依据此特征筛选岀e6Zn:e4Zn-l:9为最佳光 敏剂。在此基础上将此复合物按照40mg/kg、20mg/kg、l2mg/kg四个剂量注入 到荷瘤小鼠腹腔内，避光饲养，定期荧光诊断此复

4、合物的浓集作用及时间。研究 表明，药物的剂量对药物分布到肿瘤部位的时间影响不是很大，均可在30min 以内到达患处，但开始出现浓集现彖的时间则是随着剂量的减小而提前。关键词：二氢吓吩e6；复合物；光敏剂；HPLC；分离提纯；光敏特性；肿瘤 浓集二.氢n卜吩e6的制备及JL性质的研究STUDY ON SYNTHESIS AND CHARACTER ISTECS OF CHLORIN E6Major: Physical Chemistry Name: Jiandong HaoSupervison: Professor Yifan LuoABSTRACTChlorin e6 and its comp

5、ounds have attracted great attention in sonodynmic teatment qua novel sonosensitizers, since they combine spectral characteristics, no toxicity and tumour-collective effect However, the commercialization of Chlorin e6 and its compounds is still hindered by several technological problems, including o

6、perating conditions of synthesis, separation and purification. This article was focused on the synthesis, separation and purification methods of Chlorin e6 The Chlorin e6 were synthesised in the laboratory And their activity was studied with HPLC, UV-visible spectrum, FTIR and Fluorescence Spectrum.

7、 The main results obtained are as follows:(1) PLATISIL ODS column in chorin e6 to carry out high performance liquid chromatography(HPLC) detection.Chlorin e6 be the high-performance liquid chromatography(HPLC)detection of the best chromatographic conditions: the mobile phase was methanol: water(cont

8、aining 0%0.1mol/L ammonium acetate-acetic acid buffer solution, Ph3.2), gradient elution:methanol ratio from 85% to 100%, the proportion of water falling from 15% to 0%, elution time 40min; detection wavelength 400nm; flow rate of l.Oml/min, column temperature 25C(2) Using HPLC method chlorin e6 on

9、the synthesis conditions and to explore Chlorin e6 be the best conditions for synthesis: reaction system to be isolated from oxygen and nitrogen access, at 140C returning 25min, adjust pH to 5-6, received purity of chlorin e6 higher yield larger.in一氧吓吩e6的制备及其性质的研究(3) The use of solvent extraction an

10、d column separation method of chlorin e6 for crude separation and purification studies, and the establishment of HPLC the basis of the conditions of purification products to its detection. Select the best extraction solvent is chloroform, and the best column packing is ammonium salt so that the puri

11、ty of chlorin e6 to reach 92%(4) Study on UV-visible spectral mapping of chlorin e6 compounds Found that chlorin e6 compounds betweeen 600nm-700nm in the existence of two absorption peaks, and short-wave absorption peak Office Department long-wave peak is greater than the compound has good light and

12、 sound sensitivity. Selected based on the characteristics of e6Zn:e4Zn=l :9 as the best voice of sensitizer. On the basis of this compound in accordance with 40mg/kg, 20mg/kg and l-2mg/lg in four doses injected into the intraperitoneal tumor-bearing mice, dark rearing, regular fluorescent diagnosis

13、of this compound effect of concentration and time Studies have shown that the dose of the drug of drug distribution tu the tumor site have little effect of time, can be found in less than 30min to reach the lesion. But the phenomenon began to emerge of the time concentration is decreasing as the dos

14、e in advance.KEY WORDS： Chlorin e6； compounds； photosensitizers； HPLC； separation and purification； spectral properties； tumor concentration一氢吓吩cf的制备及共性质的研究华南师范大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文 的研究做出巫要贡献的个人和集体，均已在文中以明确的方式标明。 本人完全意识到

15、此声明的法律结果由本人承担。论文作者签名：日期： 年 月 日学位论文使用授权声明本人完全了解华南师范大学有关收集、保留和使用学位论文的规 定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属华南师 范大学。学校有权保留并向国家主管部门或莫指定机构送交论文的电 子版和纸质版，允许学位论文被检索、査阅和借阅。学校可以公布学 位论文的全部或部分内容，可以允许采用影印、缩印、数字化或其他 复制手段保存、汇编学位论文。（保密的论文在解密后遵守此规定） 保密论文注释：本学位论文属于保密范围，在年后解密适用 本授权书。非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授权 书。论文作者签名：导师签名：日期：

16、 年 月 日日期： 年 月 日第一章绪论肿瘤是威胁人类健康最凶险的疾病之一,尽管目前的主要治疗手段如抗肿瘤 药物的联合化疗、放疗和手术治疗等的作用无可置疑，但均存在着一定的缺陷， 尤其是化疗和放疗在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常细胞也不加选择性地造成了严 重的损伤。从肿瘤研究与发展的历史可发现，在继承与提高传统治疗手段的同时, 应另辟蹊径寻找治疗新途径。因此，寻找选择性好、副作用小的防治恶性肿瘤的 新方法，仍是当今医学研究的热点。在肿瘤治疗的众多方法中，靶向药物治疗、超声聚焦刀治疗等疗法以其有效、 安全、副作用小、可协同性、可重复性和相对成本低等优点脱颖而出，在治疗中 显示出很强的生命力，为中晚期

17、癌症患者，特别是无法（或拒绝）采用传统疗法 治疗的癌症恵者提供了机会。而光动力疗法就是在这一大环境下利用多科学交叉 及渗透下提出的治疗恶性肿瘤的新思维与方法。1.1恶性肿瘤的特性及其治疗方法随着对肿瘤研究的深入，目前恶性肿瘤的定义可概括为：人体内正常细胞在 众多内因与外因的长期作用下发生了质的改变，出现过度增殖，这种异常增殖非 生理需要，不符合正常细胞的生长规律。恶性肿瘤的血管多为新生的血管，多由 单层内皮构成的毛细血管和血窦；肿瘤形成后生长为自主性，常呈失控状态，而 且肿瘤特征通过细胞分裂遗传给子代，其侵袭性生长、异常代谢和异常的功能均 对机体造成危害。当丽在临床上对于肿瘤的认识基木上停留于

18、细胞水平上，除常规外科手术、 化疗、放疗外，近年来，靶向药物治疗、免疫治疗等新方法为学术界研究的热点, 具有较好的发展前景。化疗作为全身性治疗手段，对于全身性恶性肿瘤及晚期肿瘤具有较好的疗 效，同时恶性淋巴瘤、小细胞肺癌等恶性肿瘤对化疗敏感性高，为首选治疗方法。二氢吓吩e6的制备及其性质的研究近年来众多新化疗药物的岀现或化疗药物剂型的改变，提高了部分肿瘤的治疗有 效率，降低了化疗的副作用，如CPT-1K草酸钳的出现，让肠癌的治疗上升了 一个重要的台阶，肠癌治疗后的中位生存期可由原来的1.5年延长至2年。化 疗作为恶性肿瘤最广泛及有效的治疗手段，同时也存在一定问题，如少部分肿瘤, 如脑胶质瘤、骨

19、肉瘤、肝癌等，对化疗不敏感，有效率低；化疗期间出现肝肾功 能损害、骨髓抑制等毒副反应而披迫中止化疗甚至因毒副反应而带來生命危险； 长期化疗后肿瘤出现耐药及复发。放疗在我国亦为常用的治疗手段,近年来研究发现放射治疗不仅对肿瘤具有 直接或间接杀伤作用，还具有封闭肿痫微血管效应。与化疗一样，其亦具有不可 避免的缺点，如定位不准确，放射剂量不足，复发率较髙，对正常组织造成一定 的损伤，引起放射性肺炎、肠炎等不良反应3叽除此以外，还有其他一些治疗肿瘤的方法，如温热治癌及高温疗法。温热治 癌是基于42M39的高温对肿瘤细胞有选择性的热敏性，而正常组织的致死临界 温度为45.7C,因此在43C的情况下不会受

20、到损伤。温热疗法杀灭肿瘤细胞的 机理有以下几个方面：第一，由于肿瘤组织内循环系统的特点，使肿瘤组织血流 缓慢，散热障碍，受热较多，这是温热疗法对肿瘤有选择性作用的基础，但是不 同类型的肿瘤加热后血流变化不一，疗效也不同；第二，温热疗法对肿瘤微代谢 有影响，首先表现为淤血、峽氧和内呼吸抑制。加温早期局部肿瘤发生淤血，血 管扩张及血流停滞，摄氧量减少，肿瘤内氧分压严重降低，形态变化表现为细胞 腿和细胞质的变化，细胞缩小，微绒毛消失，线粒体空泡化及简勒样变，数目减 少，微绒毛消失导致表面积减少，通过膜扩散的氧相对减少。细胞内呼吸主要在 线粒体中进行，线粒体受损，瘤细胞内呼吸抑制，加重瘤细胞缺氧和供能

21、不足， 进而影响细胞内各种代谢；其次，加温导致肿瘤细胞缺氧，使细胞无氧糖酵解增 强，乳酸大量堆积，pH下降。使得溶酶体在酸性环境中增多，活性增强，碱性 和酸性磷酸酶増高，促进肿瘤细胞自我消化；第三，高温对RNA、DNA和蛋白 质的合成均有影响。尽管如此，目前温热疗法尚存在许多问题，深部肿瘤和全身 加温的控制，加温持续的时间，组织类型与加温热度、时间的关系等，因此温热 疗法有待于进一步研究旳0）。以上疗法均为单一因子对肿瘤组织的杀伤作用研究，它们均有不完善的方面，因此利用理化因子相结合的方法一直受到学者的嚏视.1.2光动力治疗恶性肿瘤及光敏剂的研究进展光动力疗法(PDT)始于70年代，现巳发展成

22、为新的肿瘤疗法。肿瘤的光动力 学疗法，含光动力学诊断(PHotodymamic diagnosis, PDD)和光动力学治疗 (PHotodymamic therapy, PDT)是指利用光敏剂选择吸收并潴留于肿瘤组织，分别 选用特定波长激光照射发出特征荧光用于诊断和诱发光化学反应以杀灭肿瘤细 胞的一种新医疗技术川。其治疗基础是生物光动力敏化作用，即化合物在恶性组 织内通过对可见光的能量传递，便周围介质中的分子氧化成为单线态氧(02)等 活性氧物质卩刀，它们与生物分子中的氧化敏感基团作用，导致其氧化失活，最 终引起肿痫细胞死亡而显示治疗作用I，3J41o1.2.1光动力作用的原发机制光敏分子与

23、光相互作用引发光动力效应。在没有光照条件下，光敏分子处于 基态So.当吸收了光子后，光敏分子首先跃迁到能量更奇的激发态，转变为受 激发的单态(SJ。接着会出现3种可能的衰变途径，即非辐射性的和辐射性的 单态衰变为基态，还有发生系间帘跃衰变到最低的三线激发态(TJ。处于三线 激发态的光敏分子衰变回基态之前会与其它分子相互作用，除主耍通过自由基氧 化还原反应或能量传递过程与周围分子发生作用外，三线态敏化分子还可以通过 分了内的振动弛豫宜接衰变回基态，见图11小】。在光动力作用中，光与光敏剂相互作用形成能杀伤基质的活性物质的过程为 原初过程。原初过程中运行机制称为原发机制。目前所公认的光动力作用的原

24、发 机制有两种：自由基氣化还原反应称作I型光动力效应机制，能量转移过程称作 II型光动力效应机制。在I型光动力效应中，自由基的光氣化是主要特征。在这 类光动力反应中，三线态敏化分子与非氧的目标分子通过氢或电子转移，释放出 中性自由基或离子化的活性基团。活性基团与基态氧发生进一步反应形成过氧化 氢或过氧化物阴离子。在II型反应中,三线态光敏化分子直接与基态氧相互作用， 生成基态的敏化剂和髙活性的单态氧(匕2)，单态氧导致细胞氣化和坏死通常在 一种己知的光动力反应体系内，I型反应和II型反应两种机制可以竞争地存在，3二氢u卜吩e6的制备及其件质的研究究竟哪种机制有利还要取决于现存的基态氧浓度及合适

25、的目标分子。图典型光敏剂的能级跃迁图Fig-1 The mechanism of photosensitizer physical changing after absorbing light1.2.2光动力治疗肿瘤的主要机理(1) 直接杀死肿瘤细胞：如PDT人肝癌后1个月，行二期手术切除的标 本，光镜下：肿瘤细胞大片坏死，肿瘤周边肝组织小叶结构正常，肝细胞索排列 规则，两者之间可见大最淋巴细胞和部分嗜酸细胞、巨噬细胞聚集。又如PDT 鼠肺癌后，光镜观察，24h：癌细胞边界不清，胞浆出现空泡性改变，出现癌细 胞坏死；72h：癌细胞坏死更加明显，癌细胞分布不规则，坏死为凝固性或液化 性坏死；15

26、d：坏死边缘有肉芽组织生长，少数残存癌细胞呈分散分布，有的全 为肉芽组织充填，未见癌细胞。再如PDT结肠癌细胞，超微结构变化为：胞膜 光滑，胞浆空泡，线粒体肿胀，内质网破坏，胞浆明显简捎样变。用维拉帕米(Verapamil, Ver)增效PDT,癌细胞结构变化为：胞膜破裂，胞浆内较多巨大空泡，线粒体明显肿胀，脊断裂，染色质溶解、消失、胞浆胞器严重变性坏死。(2) 诱导癌细胞凋亡如PDT人鼻咽癌细胞，光镜观察：PDT12h后， 细胞形态大小不一，细胞界限模糊，透明度和立体感较差。PDT24h后，细胞体 积变小，细胞质浓缩，胞核变小、固缩，染色质沿核膜内侧排列的核着边现象， 细胞界限模糊。PDT4

27、8h,胞膜收缩，核染色质浓集、边集，大部分细胞核裂解 为35块不等，呈现晚期凋亡细胞特征。电镜观察：PDTi2h后,少数细胞核开 始出现固缩，染色质浓集或边集。PDT24h后，细胞浓缩，核固缩，染色质边集, 部分细胞核出现早期裂解现象。PDT36h后，大部分细胞核裂解形成早期凋亡小 体PDT48h后,绝大部分细胞染色质浓缩并凝结成块，胞孩扭曲，裂解形成凋亡 小体。细胞凋亡指数随PDT后的时间增长而逐渐增加，48h达到高峰（95%）。（3）造成局部微血管损伤：如PDT鼠胰腺癌后，血管内皮广泛破坏，内 皮细胞边界模糊，胞核消失，血管腔消失。此外，利用放射自显影方法，观察到 HPD紧密地与血管基质结

28、合。因此能破坏癌瘤中的微血管，造成局部缺血和细 胞死亡，数日后该组织将坏死脱落。（4）増加免疫功能【：如PDT就肺癌后,光镜观察，除癌细胞坏死之外，间质内大量淋巴细胞浸润，呈大片状，尤以坏死的边缘为甚，吞噬细胞数量也较 多。此外，边缘为甚，吞噬细胞数駅也较多。此外，边缘为甚，吞噬细胞数虽也 较多。此外，PDT能明显提高胸腺和脾的淋巴细胞转化率，提高CD4+/CD8+比 值，增强脾细胞NK活性及LAK活性。1. 2. 3光敏剂光动力治疗在很大程度上取决于光疗药物（光敏剂）的性质。光敏剂是一种本身（或其代谢产物）能选择的浓集于要作用细胞的化学物质，它（或其代谢产物）在适当波长光的激发下能产生光动力

29、效应而破坏靶细胞。光动力疗法的提出、发展及应用都是随着光敏剂的发展而逐渐完善的。理想的光敏剂应具备以下特点：组分单一，结构明确，性质稳定；在光照时具有强的光毒性，对机体无副作用、 安全；与正常组织相比，在靶组织内有相对的选择性存留，而又不会在体内滞 留过久；光敏化力强，三线态氧春命长而且产量多；在光疗窗口（600-900nm） 有强吸收，以利于治疗时采用对人体组织穿透较深的光源：在生理pH值可溶 解问。H前，还没有完全满足这些条件的光敏剂。下面就光敏剂及其发展做一简要5二氢吓吩e6的制条及其性质的研究介绍。(1) 第一代光敏剂(列第一代光敏剂血吓衍生物(HPD)和PHotofrin多为混合制剂

30、，在体内的滞留 时间长，避光时间需4周以上；它们的最长激发波长在630nm,此波长穿透的组 织深度有限(复杂的如 靶组织表达的抗原或受体的相应抗体和配体等。如氨基酸偶联光敏剂、聚合物偶 联光敏剂、蛋白质或糖偶联光敏剂等。目前第三代光敏剂多处在动物研究阶段， 例如与各种物质交联的和猷普。1. 2.4肿瘤光动力疗法的缺陷光动力学疗法冃前仍然存在较大的缺陷，如激发光的组织穿透力较差，无法 有效激发潴留于深部组织中的光敏物质。因此，寻找组织穿透力强的激发源成为 人们关注的焦点。声动力学疗法是近年來继光动力学疗法之后兴起的肿瘤治疗新 方法，在恶性肿瘤的防治中表现出良好的应用前景超声作为一种机械波，对生物

31、 组织有较强的穿透力，且聚焦超声可无创伤地将声能聚焦于深层组织，无需通过 内镜，操作简便，利用超声作为激发源有望克服目前光动力治疗存在的诸多局限 性。1.3声动力治疗恶性肿瘤及声敏剂的研究进展声动力疗法(Sonodynamic therapy, SDT)是在光动力疗法基础上发展起来的 一种肿瘤治疗新理念、新方法，冀能如光动力特异性杀伤肿瘤的同时又能避开其 缺点。声动力治疗恶性肿瘤的过程主要是通过肿瘤患者口服或静脉注射声敏剂， 声敏剂通过血流分布全身并能特异性在肿瘤细胞内浓集，然后用一定频率和强度 的超声波照射肿瘤位置，声能可激活声敏剂，使其产生一系列化学反应(如产生 单态氧)，导致肿瘤细胞的不

32、可逆性损伤，从而达到治癌目的。与光动力治疗相 比，超声对人体组织有有十分强的穿透能力，可无创伤地照射深层组织。因此无 需借助其它介入手段即可对部分深部肿瘤进行治疥，其毒副作用更低，治疗更广 泛冋。/ vJ wl I I wvJ I I1.3.1声动力治疗恶性肿瘤杀伤机制SDT研究至今，人们对其作用机理已经进行了许多探索，在超声空化的基础 上提出了许多理论，然而目前仍不清楚。主要的有超声空化效应、单线态氧理论、 自由基理论等。(1) 超声空化效应超声空化是指在声波作用下，存在于液体中的微小气泡(空穴)所发生的一系列 动力学过程：振荡、扩大、收缩乃至朗溃。其活动强弱与超声的频率和强度有关。 当超声

33、效应的产生是与空化活动相关联时，便可检测到伴随空化所发生的某些现 7二氮吓吩e6的制备及其性质的研究辣，如化学反应、发光、次谐波等。按空化泡不同的动力学行为，可分为稳定空 化和瞬态空化两种类型。稳定空化是指空化泡在平衡位置振荡而不发生破裂，其 生存周期长。瞬态空化是指气泡生长，收缩，再生长，再收缩，经多次周期性振 荡，最终以高速度崩裂。瞬态空化泡崩溃时，形成局部髙温高压可引发自由基0H 和H及02的形成。两种空化泡都能对组织和细胞造成物理损伤，但只有瞬态空 化能引发声化学反应而杀伤细胞。Worthington等人以】通过超声激活血吓咻造成 CH0细胞溶胞作用及其克隆能力丧失现彖的观察，发现在此

34、过程产生的自由基很 少，难以造成细胞死亡，认为这是由于瞬时空化的强烈作用损伤细胞膜而导致细 胞死亡。(2) 单线态氧机制1990年，Umemura等人心】对超声结合Hp致腹水型S180细胞坏死的机制进 行了研究，实验发现趙声激活血吓咻对S180细胞的杀伤作用可被活性氧淸除剂组 氨酸所抑制，而不能被尧自由基清除剂甘露醇抑制，从而提出了超声波活化Hp 产生的单线态氧(singlet oxygen, |。2)是SDT杀伤肿瘤细胞的重要因子，即“单线 态氧机制”。该理论认为超声过程中超声空化导致声致发光，从而由光激活空化泡 内或临近的光敏剂分子而产生具有细胞毒性作用的单线态氧，02具有较大的扩散 半径

35、，能穿透线粒体膜，参与电子传递和氧化作用；能穿透核膜，造成DNA的损 伤以及导致胞膜脂质过氧化而杀伤细胞等。随后他们以D20代替水做缓冲液以及 釆用ESR等技术的实验结果皆支持单线态氧机制。1996年，Yumita1261实验证实超 声结合血吓咻导致细胞膜脂质过氧化可被组氨酸、叠氮化钠、氮饱和气明显抑制， 被氧化笊促进，而超氧歧化酶、甘壽醇无抑制作用。(3) 自由基理论2000年，Miyoshi1271采用能与单线态氧特异反应的捕捉剂-DRD156来检测单 线态氧的产生。实验结果表明，当用超声照射含有DRD156的HP或Rose Bengal 溶液时，未检测到单线态氧。相反，当用505 nm的

36、光辐照含有DRD156的HPD 或用544nm辐照含有DRD156的Rose Bengal溶液时却检测到了这种信号。于是 提出烷氧自由基和过氧化氢可能在声动力疗法中起着主要作用，因为烷氧自由基 和过氧化氢与溶解于生物介质中的成分之间的反应活性很低，因而到达细胞中重 要部位的可能性要高27%。Misik冋等对氮DMF、MMF、DMSO水溶液进行超声 照射后，以DBNBS和DMPO作为自由基捕捉剂，采用电子自旋共振检测到來自 这些物质的、以碳为中心的自由基。Miyoshi在研究ATX-70对离体培养的HL-525 和HL的作用中发现，ATX-70优先在空化泡的汽液界面富集，在瞬时空化的作 用下而分

37、解产生了来源于ATX-70的自由基。在多年的研究基础上，Misik认为 SDT是由于超声的空化作用激活空化泡内或临近的光敏剂，通过直接热分解弱键 或与水热分解形成的H和OH反应，产生光敏剂来源的自由基，自由基再与02 反应形成烷氧自由基和过氧基，烷氧自由基和过氧基与有机溶液中的有机分子反 应活性低，更容易到达靶细胞而发挥作用。1. 3. 2声敏剂声动力治疗除了所需要的设备以及治疗时的声频率、声强度、作用部位和作 用时间外，更重要的是其产生木质作用的声嬪剂，声敏剂的选择与作用效果决定 于声动力治疗的成败。因此，声敏剂的研究已成为当前声动力学疗法领域中最为 关键的问题。自1989年日本学者梅村晋-

38、郎提出声动力疗法概念后（约，对于寻 找合适声敏剂的研究从未间断。为此近20多年来，人们对各类声敏剂进行了广 泛的研究。早期的声敏剂都为光敏剂，以血吓咻为主，随后逐渐出现吓咻类衍生物，如 ATX-70、ATX-S10等经改良的铢吓財衍生物，而近年人们更对一些非吓咻类的 化合物是否存在声敏作用而展开了研究。另外，更有学者将声敏剂与其他药物结 合以提高治疗效果或增强紀向性。1989年，Yumita等人最早利用超声照射S180和AH-130肿瘤细胞，发现 有一定的破坏作用，当加入血吓唏（HP）后，破坏作用更为显著。同年亦有类 似报道发现趙声与HP配合使用可使肿瘤细胞坏死，而单独使用HP无杀伤效果， 从

39、此对PDT的研究相继展开。由于利用HP作为声敏剂的抑瘤效果停留在74% 左右，故最初的研究都以发展高效的声敏剂为冃的，对吓咻类运用化学修饰等方 法，发现了一系列相对高效的稼吓咪衍生物，如ATX70。Umemura等人】比 较了 ATX-70和HP对S180细胞的影响，在细胞悬液中加入80pmol/L的ATX-70 和HP,用2.0Mhz的超声波照射，发现HP组引起的细胞坏死为对照组的2倍， 而ATX-70则为4倍，因此推论ATX-70为有潜力而高效的声敏剂。Yumita等人 9吩c6的制術及英性质的研究（犹列研究另一种傢吓瞻衍生物ATX-S10,用超声照射加入药物后的S180细胞悬 液中，可使

40、肿瘤细胞损伤。并使NO的浓度升高，作者后来体内及体外的实验研 究也再次证实了 25mg/kg的ATX-S10在2Mhz的超声照射下对S180细胞存在杀 伤作用。而ATX-S10的主要优点则在于毒性较小。Umemura等】则用脱镁叶绿 甲酸一酯（Pha）对S180细胞进行了相关体内及体外PDT实验。结果发现体外 实验时，80Hmol/L的药物可以使超声损伤细胞的能力增加2倍。体内实验时超 声加Pha的抑瘤率达到77.3%,而此时应用的剂駅仅为血吓魅用量的十分之一， 因此对人体的副作用也相应减少。在研发高效声敏剂同时，部分研究开始关注声敏剂T/N比，希望选择一个 最佳的时间段，令PDT对肿瘤组织的

41、作用最强，而对正常人体组织构成的影响 最小。Sasaki等卩刃对结肠癌皮下移植小鼠静脉应用ATX-70,之后检测血与肌肉、 皮肤的药物浓度。发现用药后2h至6h之间内ATX-70在肿瘤中的浓度较高，但 在6h内，药物在其他正常组织内还蓄积得较多。因24后肿痫/血浓度、肿瘤/皮 跌或肿瘤/肌肉浓度比值最好，认为在用ATX-70后24h应用超声相对适合。此试验开始对声敏剂在正常组织和肿瘤组织的停留时间进行研究，但此后类 似的研究较少见，另一例子见于Uchida等【均以光吓嚥（pf）作为声敏剂对白血 病细胞MT2、正常人外周血单核细胞和成人T细胞性白血病病人的外周血单核 细胞进行SDT治疗，同样发现

42、在用药后24h后肿瘤/正常组织药物浓度比最好。 作者同系列的研究中还发现MT2细胞和T细胞性白血病病人的外周血单核细胞 运用SDT较单用超声时细胞的存活率有所下降，且与PF的药物浓度成负相关关 系。而且对于正常人的外周血单核细胞而言，加用SDT则彩响不大，作者提示 该方法可用于急性口血病人的体外血液疗法。随着研究的深入，部分学者认为某些药物或化学物质可能也存在声敏效应， 于是在传统吓际类化合物的研究主干上出现了非吓咻类化合物的分支。国内外学 者分别对非辎体抗炎药、某些抗生素、猷普类物质进行了研究，大多有可喜的进 展，为寻找新型声敏剂提供了崭新的方向。Misik等卩7】的研究发现二甲基亚酰胺（D

43、MF）、N甲基甲酰胺（MMF）、二甲基 亚RDMSO）三种化合物存在情况下，超声激活也可以导致过氧基的产生，对细 胞造成损伤。从而提示此三种物质可考虑作为声敏剂而发展，同时也证明了非吓 瞩类的物质也存在着声敏效应，可对肿瘤产生杀伤作用。Yumita1381等人应用了 S180细胞对四碳荧光素(Erythrosin B, EB)进行了研究，发现这种荧光素的碘 化衍生物在超声照射下，其对S180细胞的杀伤作用较单纯应用超声照射时要强 4-5倍，而单用EB则肿瘤细胞无损伤。但EB的缺点是对肿瘤组织的选择性比 较低，故还难以应用于临床。OkadaW)等人发现非焉体抗炎药替诺昔康、炎痛喜 康在超声照射下

44、也可以对S180细胞产生杀伤作用，尤其以替诺昔康明显，效果 甚至优HP；而且此作用能被活性氧清除剂所抑制。更重要的是，这两种药物毒 副作用很低，是抗炎常用的药物。此类药物符合了良好声敏剂所要求高效、低毒 的条件，可惜研究中并无提及该药物是否能特异性蓄枳在肿瘤组织中，以及其 T/N比是否良好，今后尚须进一步研究。最近，一些抗生素也被列入声敏剂的研 究范围当中。阿布素及其同类的蔥环化合物(THP、FAD104)也被证实了存在 声敏作用，有较好的研究丽景。Huang D等刚)人发现新嗪诺酮药物司帕沙星 (sparfloxacin, SPFX)在超声激活下照射S180细胞悬液，结果肿瘤细胞的生存 率为

45、30.9%,远低于对照组，具有显著差异。而且在实验组的病理观察中发现， 肿瘤细胞呈不规则的半球型，细胞膵经常被破坏，甚至有些细胞完全被破坏。同 年，作者发现洛美沙星(lomefloxacin hydrochloride, LFLX), 环丙沙星 (ciprofloxacin hydrochloride, CPFX) 加替沙星(gatifloxacin hydrate, GFLX)这些新 哇诺酮药物同样具有声敏作用，超声激活可以使其产生单态氧，从而杀伤肿瘤细 胞这些药物有望成为富有发展潜力而又相对安全的声敏剂。Suzuki】等人运用超声照射HP与丝裂霉素的结合物，在低功率时也表现出 对肿瘤的抑制

46、作用。AbJ431等人进行的研究更是为SDT和免疫疗法的结合提供了实验基础。他 们利用癌胚抗原的抗体与ATX-70结合，形成了 F39/ATX-70复合物。此物与超 声联用对癌胚抗原表达阳性的人胃癌细胞有明显的杀伤作用，且其效果远大于单 用ATX-70,而且具有很强的靶向性。更重要的是，此研究为声敏剂研究提供一 个新方向：以声敏剂为“弹头”，再以对肿瘤靶向性强的药物作为导向载体，两 者结合可能使药物对肿瘤组织的特异选择性更為，可减少声敏剂的用屋以及副作 用。近年來声动力因目前采用的声敏剂以光敏剂为主，其在体内正常组织内蓄枳 11二氢U卜吩c6的制备及其性质的研究时间长，排泄速度很慢，因此在超声

47、照射时可对正常组织造成损害；而且治疗后 病人仍需避光，否则会引起光照性皮炎。从理论上说，理想的适于人用的声敏剂 应当具备以下几个条件：1）必加无毒；2）对肿瘤有高度的特异的选择性；3） 非肿瘤组织清除率要高；从而在用药后某个时间段，能有一个最佳的T/N比（肿 瘤声敏剂含量与正常细胞含鼠之比），疗效更高又更安全；4）对超声波奇度敏感（声化效应强）：5）最好对光也敏感。故本研究就是基于寻找新式高效、低毒的 光敏剂而开展的。1.4光敏剂的合成与检测的研究状况1.4.1二氢口卜吩e6合成与检测叶绿素a降解产物衍生物是近年來国内外发展第二代光动力治癌新药的重点 研究对象之一.叶绿素a降解产物衍生物可分为

48、三类：脱镁叶绿酸a及其衍生物; 二氢叶吩e6及其衍生物；紫红素18和二氢吓吩p6及其衍生物。姚建忠等由家 蚕粪降解分离得二氢口卜吩e6,见图1-2,以此为原料合成了各种衍生物，并对小 鼠S180移植肉瘤进行光动力实验，实验结果表明二氢吓吩e6衍生物有较强的光 敏效应，且治疗效果明显好于HPD。实验证明，二氢吓吩e6在体外可以对人黑索 瘤A-375细胞产生光动力学效应，能否应用于临床，还需要更进一步的研究【倒。图1-2二氮吓吩e6的合成方法Fig.l -2 The synthesis of Chlorin e6图1-2为二氢叶吩e6的合成方法，报道中均没有详细的二氢吓吩e6合成的 具体条件及其控

49、制方法；而检测分离方法章玲等人【呦仅仅提到了薄层层析法和 柱层析法检测及鉴定二氢吓吩e6,薄层层析法存在着一定的不稳定性，而且大 批量生产存在着一定的局限性，柱层析的方法条件为：柱填料：硅胶；流动相： 氯仿甲醇-甲酸（10:1:0.1）,根据二氢吓吩e6的结构及极性分析，柱填料选用硅 胶分离二氢吓吩e6的效果并不佳。1. 4. 2其他光敏剂的合成1.4.3.1二氢口卜吩e4的合成二氢吓吩e4作为新型的光敏剂与二氢口卜吩e6结构相似，脱去了二氢吓吩e6 三个竣基的中间一个，由于二氢吓吩e6的合成条件及分离方法并没有明确的报 道，所以关于二氢口卜吩e4合成与检测的文献报道很不多见。姚建忠等人中报

50、道的二氢口卜吩e4的合成方法为，取二氢吓吩e6溶于毗曉,回流后用酸中和pH5-6, 过滤干燥，得粗品，见图13。图1-3二氢吓吩e4合成方法Fig. 1-3 The synthesis of chlorin e4其中条件不明确，而且分离鉴定方法也没有给出，考虑其结构与二氢吓吩e6相似，检测方法也应该有所关联，故做好二氢吓吩e4合成及检测的前提是确二氫吓吩e6的制帶及英性质的研究定二氢吓吩e6的合成条件及分离检测方法。1.4.3.2二氢口卜吩f及紫红素18的合成姚建忠等人锄中以市售糊状叶绿素为原料，经浓盐酸酸降解反应制得脱镁 叶绿酸a。脱镁叶绿酸a与25%氢氧化钾甲醇液于0C条件下通氧气反应lh

51、后迅 速回流反应0.5h制得二氢吓吩f,采用了高效液相色谱法对二氢吓吩F进行分离 鉴定，条件为：流动相：60%THF水溶液+10%0.2mol/L醋酸-酷酸钠缓冲液（pH 3.2）,流速lml/min,检测波长400nm,柱温2O1C。首先根据二氢吓吩f的结 构，流动相使用THF成本很高，在高效液相检测中也存在着一定的危险性，柱 温的影响不是很大，但考虑到柱效及流动相的一些特性，20l*C尚需探讨。李翠华等人【切脱镁叶绿酸a与25%氢氧化钾正丙醇液于0C条件下通氧气反 应2h制得紫红素18,见图14reflux图1-4二氢吓吩f及紫红素-18的合成方法Fig-4 The synthesis o

52、f chlorin f and purourin-18二氮0卜吩e6的制条及其性质的妍究1.4.3.3二氢吓吩e6二甲酯及N乙基二氢吓吩e6甲酰胺的合成脱镁叶绿酸a粗品加入含0.5% KOH的甲醇溶液，通入2搅拌反应10h, 用浓HCI调至中性，加水，过滤得二氢吓吩e6二甲酯粗品：脱镁叶绿酸a粗品 溶于氯仿，滴加乙胺氯仿溶液，室温密闭静置过夜，至TLC检测出紫色斑点， 加水稀释，用4%HC1调节pH5-6,用氯仿萃取，合并氯仿相，水洗，氯仿层用 无水Na2SO4干燥过夜，过滤得N乙基-二氢吓吩e6甲酰胺粗品，合成方法呵 见图l-5o二氢吓吩e6二甲酯N-乙基-二氢吓吩e6呷酰胺图1-5其它二氢

53、u卜吩e6衍生物合成方法Fig-5 The synthesis of chlorin c6 derivatives由图13.图14、图】-5可以看岀，很多的光敏剂的基本结构与二氢U卜吩e6 相似，而且合成方法与二氢吓吩的方法也类似，甚至有些是在二氢吓吩彬的 结构上进行修饰改造的，所以合成出纯度较高的二氢吓吩e6是关键所在。1.5光敏剂的光谱性质及荷瘤鼠的荧光诊断光敏剂经适合波长徼发后，可发生两种光动力反应产生活性氧物质(Reactive oxygen species, ROS)旳。SDT就是用光动力反应产生ROS而达到治疗肿瘤目 的的，而单独积聚在肿瘤组织内的光敏剂或单独照射在肿瘤组织上并无治

54、疗作 用。而测定和研究新型光敏剂的光谱特性，是声动力学诊断和治疗癌症应用中首 先关心的问题，它是确定最佳诊断和治疗光源波长的宜接依据，同时也是荧光诊 断中选定检测荧光波长的理论依据卜儿荧光诊断法运用在肿瘤诊断方面的报道已很多见，万小平等人旧】通过对36 例大肠癌患者的癌组织、癌旁与远癌组织中血吓唏含鱼采用化学抽提与荧光分析 法进行定量分析；丁爱华等人(旳通过癌固有荧光发光机制探讨的模拟实验，观 察到肿瘤组织的固有银行股光发射与吓咻的荧光发射光谱基本相同，说明吓咻在 肿瘤中的存在；又观察到吓喊及吓麻与蛋白的结合物发光电光谱图与临床诊断癌 的固有荧光光谱的特征峰基本相同，初步认为癌固有荧光的发光与

55、吓喊及癌组织 中的某种蛋白结合有关，故认为此诊断方法有一定的理论根据及临床应用价值。1.6选题意义与目的二氢吓吩e6作为新型的光敏剂，其优点在于产生单线态氧量子产率的能力 高，暗毎性极低，在体内浓集时间短，毒副作用小等。为此本课题研究二氢吓吩 e6合成最佳方法，包搖反应中的氧气、温度、反应时间和酸碱度的研究与优化; 探讨了二氢吓吩c6分离、纯化与检测方法，分别采用高效液相色谱法、溶剂萃 取法和柱分离方法进行分离检测；研究了二氢吓吩e6复合物的光谱性质及光照 超声对其体外干预的作用，进而探讨不同浓度的光敏剂腹腔注射于荷瘤鼠体内， 观察活体内光敏剂到达肿瘤部位的时间及浓集的时间，为开发用于治疗恶性

56、肿瘤 的光敏剂做准备。本课题的研究为二氢吓吩e6的合成、分离、与检测提供技术方法，为开发 二氢卜吩e6组合光敏剂复合物提供了生产技术；同时通过光敏剂药效、药理和 暗毒性及光毒性等评价，筛选出具有生物学活性高、毒副作用小的药物，为二氢 吓吩e6类光敏剂治疗恶性肿瘤提供实验依据,为二氢口卜吩e6类光敏剂的临床试 验提供基础。#二氮叶吩t6的制备及K性质的研究参考文献1许川山，王志刚，虞乐华等.肿瘤声动力学疗法的研究现状与展望卩临床 超声医学杂志,2005,7(1): 373&2许川山，余茜，石含英等.肿瘤的光动力与声动力诊断J.激光杂志，2004, 25(2): 90-91.3孙肚惠.超声激活血叶啦对SI80瘤细胞杀伤作