蛋白质组学部分题目

1、蛋白质组学课程试题简答题（每题10分）1、自由流电泳分离蛋白质的机理及其优缺点。自由流电泳（CFFE）是在无固相支持介质的薄的矩形分离中，以缓冲液为分离介质进行生物大分子或不溶性颗粒及细胞等物质的分离纯化技术。在CFFE中，分离介质在两块平行的矩形板组成的分离腔内形成层流（两板之间的距离通常介于0.5-3.0mm）分离腔的两侧为正负电极室。被分离物质由一口径很小的输入口进入分离介质中，形成一细带，在垂直于液流的方向上加上均匀的电场后，样品中各种组分由于各自电泳迁移率的差异而各自向与所带电荷符号相反的电极以不同的速度迁移，相同电泳迁移率的物质则迁移为一窄带，在到达分离腔出口处由分级手机器收集。优

2、点：CFFE是一个连续的而不是分批进行的分离过程。同时由于它不使用有机溶剂、高盐溶液，及硅胶或凝胶等支持介质，分离调节相当温和，对有活性的生物材料的分离纯化提供了十分合适的分离环境。缺点：因自由流电泳是完全无载体的液相电泳，因此除了电泳本身所固有的影响因素外（如：焦耳热，电动力学变形），还有层流（流体力学变形）以及一些综合因素的影响（电流体力学变形等），且这些过程常常互相关联，使整个过程变得极其复杂。重力对自由流电泳会产生影响。颗粒沉降、小滴沉降和热对流是影响自由流电泳的三种重力现象，在微重力条件下这些现象几乎消失，这使CFFE的放大在空间有可能得到实现。2、质谱仪的组成及其主要技术指标。质谱

3、仪一般由进样装置、离子化原、质量分析器、离子检测器、数据分析系统组成。其中，离子化原用来待分析的分子转化成气态离子。在质量分析器中，不同荷质比m/z离子在一个随时间变化的电场作用下分离。离子检测器用来接受在质量分析器中分离的带有不同荷质比的离子检测m/z值以及不同m/z的离子密度。主要技术指标包括：灵敏度，分辨率，准确度，稳定性，质量范围，动态范围3、蛋白质组学定量分析方法的主要原理。蛋白质组学定量分析主要包括两种方法：1、建立在2DE基础上的电泳方法：其原理是通过比较通过比较蛋白质在不同胶上的染色强度来进行相对定量。提供蛋白质表达水平的信息。2、利用质谱检测技术：对来自不同样品的肽段标上一个

4、内部标准，使得可以识别不同样品来源的肽段，以质谱峰的信号强度就可以作为定量的依据。4、请列举预测蛋白质相互作用的方法。1、酵母双杂交法：主要原理是将可能存在相互作用的蛋白之一与Gal4的DB结构域融合。 另外一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合。 如果在两个待测蛋白之间存在相互作用, 那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活相应基因的转录与表达。 通过对报道基因表达产物的检测, 反过来可判别作为“诱饵”和“猎物”的两个蛋白质之间是否存在相互作用。2、免疫共沉淀法：免疫共沉淀是一种比较经典的蛋白质相互作用方法，其实验比较简单。裂解细胞后，加入抗体，

5、抗原被沉淀下来后洗涤，去除非特异性亲和再分析结合复合体。目前常使用Pulldown实验结合免疫共沉淀可以对可能的蛋白质相互作用进行验证。3、高通量质谱蛋白质鉴定：使用一分子标签如FLAG标记把蛋白，使融合蛋白在细胞内过表达。通过免疫亲和（FLAG抗体）捕获到抽提物中把蛋白形成的蛋白质复合物。SDS-PAGE分离复合体各组分，胰酶酶切后，进行质谱分析。此法适合于分析天然状态下细胞内浓度较低的蛋白质，但是如果蛋白质浓度过高则背景较强，产生假阳性。4、串联亲和纯化（tandem affinity purification, TAP）：该技术核心是设计一个双重分子标签，包括A蛋白（IgG bindin

6、g protein）、TEV蛋白酶切位点、钙调素结合蛋白。将TAP标签构建到靶蛋白上，然后在宿主细胞内表达融合蛋白，表达水平接近把蛋白的天然状态。可以与把蛋白相互作用的其他蛋白质结合到融合蛋白上，形成复合体。细胞裂解物和IgG基质温浴在一起，通过A蛋白复合物结合在IgG上。冲洗后，加入TEV蛋白酶，洗脱复合物。在Ca2+存在的情况下，洗脱液与包被钙调素的温育在一起，复合物就结合在珠子上。进一步洗去杂质后，加入EGTA鳌合，复合物脱落。SDS-PAGE分离复合体各组分，胰酶切割后进行质谱分析。该方法检测到的蛋白质相互作用更加接近自然条件下蛋白质的性质，包括浓度，定位和翻译后修饰。适合于检测大量蛋

7、白质之间的相互作用而形成的复合物，而不局限在两个蛋白质之间相互作用。但是不能检测蛋白质复合物形成的顺序。需要与酵母双杂交等方法互补。5、系统生物学研究的主要流程是什么？1. 对前人的实验进行总结，获得大量关于系统的信息，在已有的大量数据（如：基因组，蛋白质组，转录组，代谢组等数据）的基础上，对选定的某一生物系统的所有组分进行了解和确定，描绘出该系统的结构，包括基因相互作用网络和代谢途径，以及细胞内和细胞间的作用机理。以此构造出一个初步的系统模型。这是一个由数据得到模型的过程。2. 对模型进行精炼，并在这个初步模型的基础上对可能的现象，或某些实验的结果进行预测。3. 根据模型作出的预测设计实验证

8、明或证伪初步模型，如：系统地改变被研究对象的内部组成成分（如基因突变）或外部生长条件，然后观测在这些情况下系统组分或结构所发生的相应变化，包括基因表达、蛋白质表达和相互作用、代谢途径等的变化，并把得到的有关信息进行整合。这样又从实验中达到了大量的数据和信息。这个过程需要实验室中真实的实验。4. 把通过实验得到的数据，信息与根据模型预测的情况进行比较，根据实验结果与模型预测结果的差异程度对初始模型进行修正，或抛弃。5. 如果模型不被彻底抛弃，则根据新实验数据修正后的模型则取代了原有模型，利用这个模型仍可进行预测，并据此设计和实施新的改变系统状态的实验，重复上述各步骤，不断地通过实验数据对模型进行

9、修订和精练。6、试述如何应用2D-PAGE进行差异蛋白质组学的研究，并分析其优缺点。2D-PAGE原理是根据蛋白质的等电点和分子量的差异而使之分别在等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）和聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）中分离出来。应用2D-PAGE进行差异蛋白质组学研究主要步骤有：1、在应用2D-PAGE研究差异蛋白质组学问题时首先要获得要进行差异比较的组织，如肿瘤组织与癌旁正常组织，然后裂解组织和细胞，抑制蛋白酶活性，出去非蛋白质的DNA，RNA，脂类等物质，溶解蛋白质，溶解并抽提总蛋白质。2、将准备好的蛋白质进行2D-PAGE实验，先选择合适的PH范围进行等电

10、聚焦，平衡胶条，再进行第二维的聚丙烯酰胺凝胶电泳。3、对2D凝胶进行染色处理（可选择各种染色方法），利用软件分析比较成对组织的2D结果，找到上调或下调的蛋白质点。4、将有差异的蛋白质点切割下来进行质谱分析，质谱谱图通过查询数据库找得蛋白质点对应的蛋白质。5、对于得到的有差异的蛋白质要进一步进行验证，常用的手段包括：Western Blot, RT-PCR, 免疫组织化学等。利用2DPAGE进行差异蛋白质组学分析的优点主要在于：1、效率高：目前，一块胶板(16cm20cm)可检测到30004000个甚至10000个蛋白斑点。2、可重复性好：80年代开始采用固定化pH梯度胶的IEF，克服了载体两性

11、电解质阴极漂移等许多缺点而得以建立非常稳定的可以随意精确设定的pH梯度，可建立很窄的pH范围(0.05U/cm)，对特别感兴趣的区域做第二轮分析，大大提高了分辨率。固定化pH梯度胶已有商品生产，基本解决了重复性的问题；3、灵敏度高：SDS-PAGE有垂直板和水平超薄胶电泳两种方法，可分离10100kD分子量的蛋白质；银染色法可检测到4ng蛋白，同位素标记法最灵敏，可测定20ppm的标记蛋白。利用2DPAGE进行差异蛋白质组学分析的缺点主要在于：1、对盐，DNA等杂质高度敏感。2、对于溶解度低的输水性蛋白质，酸性，碱性蛋白质效果不好。3、对PH和MW的范围有所限制。4、耗时，无法自动化。7、翻译

12、后修饰（包括糖基化、磷酸化、泛素化等）的蛋白质组学研究中共性核心技术是什么？简述如何将这些技术应用到你的课题研究中。研究翻译后修饰的蛋白质组学方法的共性是都要首先从细胞或组织的总蛋白中分离出带有特定修饰集团的蛋白质，然后经过电泳，酶解，富集有修饰的肽段，最后通过质谱分析和数据库检索确定被修饰的蛋白质种类以及被修饰的位点。例如：设计如下的蛋白质组学课题“高通量寻找食管鳞癌组织中磷酸化修饰异常的蛋白质”，则可以按照上述核心技术流程设计以下实验：1、设计并制备磷酸化蛋白特异性抗体（单抗或多抗）。2、分别从食管癌组织和癌旁正常组织中提取总蛋白。3、分离磷酸化蛋白：使用磷酸化特异性抗体进行免疫共沉淀。或

13、者将磷酸化抗体连在亲和层析柱上，将总蛋白过柱分离磷酸化蛋白质。4、分离得到的食管癌组织的总蛋白和癌旁正常上皮的总蛋白分别进行2DPAGE实验。5、用软件分析比较2D-PAGE胶，找到有差异的蛋白质点，则可能是磷酸化修饰异常的蛋白质。6、选取差异的蛋白质点，用酶切成肽段。7、采用亲和层析法富集磷酸化肽段（因为磷酸化肽段在总肽段中所占比例少，需要富集）。8、进行质谱分析，数据库检索确定磷酸化肽段序列。再进一步确定磷酸化的蛋白质。9、为了提高结果的可信度还要在体外验证结果的真实性。如果有条件还要在较大样本中确定这种磷酸化修饰的异常在人群中的比例，以及与食管癌发生发展的关系。实验设计题（共30分）根据

14、蛋白质组学研究方法，结合本实验室的研究方向，设计一个相关蛋白质组学实验。（包括研究意义、国内外研究现状及参考文献、研究方法及流程、预期结果）食管鳞癌异常表达的蛋白质研究一、背景，研究意义食管癌是人类常见的恶性肿瘤之一，其死亡率分别位居我国和世界恶性肿瘤的第四位和第七位。原发的食管癌主要包括腺癌和鳞状细胞癌两种类型，西方的白人以腺癌为主，东方的黄种人以鳞癌居多。遗传易感性也是食管癌发生的重要因素。我国河南、山西、山东等省食管癌高发区的调查显示食管癌患者有家族史者为24%61%。在一个家族中，食管癌可在同一代或连续两到三代内发生。食管癌这种明显的家族聚集现象显示出一些遗传易感基因可能在其中扮演重要

15、角色。大量研究资料表明，基因异常改变的积累以及蛋白质表达谱的异常干扰了细胞的正常生物学行为，导致细胞恶性增殖。最常见的基因改变是原癌基因的激活和抑癌基因的失活，二者通过参与细胞周期的调控、信号传导、细胞分化及凋亡等事件，引起肿瘤的发生和发展。尽管食管癌发生的分子遗传学研究已经有了很大的进展，但我们对于它认识仍然相当不足。目前，还没有找到一个临床上可用的诊断特别是早期诊断的分子标志物或一个很好的基因治疗的靶点。近年来不断进展的蛋白质组学为我们提供了一个新的研究食管癌发生、发展分子遗传学事件的平台。蛋白质组学以蛋白质组为研究对象，是在蛋白质多肽谱和基因产物图谱技术的基础上发展起来的一门学科，旨在阐

16、明生物体全部蛋白质的表达模式及功能，具体包括蛋白质的表达、存在方式（修饰形式）、结构、功能和相互作用等。蛋白质组研究的显著特点在于其动态性，这种动态的特征是指某种生物蛋白质组随着空间和时间的变化而变化，表现为生物体内不同的器官、组织、细胞的蛋白质组是不同的；同一种组织中位于不同层次的同种细胞表达的蛋白质组也不同；在不同的营养状况、温度、压力环境、药物等作用下细胞和组织蛋白表达谱也在变化。所以应用蛋白质组学手段有望从蛋白质表达水平阐明食管癌发病的分子机理以及寻找候可用于治疗或诊断的标记蛋白。二、研究现状根据文献报道，多年来利用比较基因组/蛋白组组学方法，人们已经找到部分基因/蛋白质在食管癌中表达

17、异常，包括：Cyclin D1, Rb, p16, p53, mdm-2, EFGR, c-erbB-2, int-2, hst-1, Bcil-2, p450(CYP), ADH2, ALDH2, MGMT, E-cadherin, FzE3, BMPs, MK, Grb7, MTA1, COX-2, FEZ1, G-g7, CAAF1, MAL, SPRR3, TGM3,Cystain B等。三、实验设计总体思路食管癌的发生被认为是一个复杂过程，涉及多个基因的改变。本实验准备采用比较蛋白质组学的方法，使用2-DE比较食管鳞癌及其癌旁正常食管上皮的蛋白质表达谱，揭示其中差异表达的蛋白，之后通

18、过质谱对这些蛋白进行鉴定，并用RT-PCR、Western blot和免疫组织化学等方法对鉴定出的蛋白在mRNA和蛋白水平的变化进行验证和初步的功能分析。通过这样的技术路线，希望能够找到与食管癌发生、发展及转移相关的蛋白，为阐明食管癌发病的分子机理、寻找候选标记蛋白以及发展早期诊断和生物治疗提供线索。四、具体实验步骤（一）准备工作（组织切片，提RNA，提蛋白质等）1、冰冻切片：从临床获得手术切除的新鲜食管癌组织标本（取多个病例的组织标本，每例标本均包括肿瘤组织以及手术切端正常组织），进行冰冻切片，切片分为两种：厚切片用于显微切割，薄切片用于HE染色。2、根据HE染色的情况，在显微镜下对比厚切片

19、和薄染色切片中的正常上皮和肿瘤细胞的分布情况。根据HE染色定位切片中切割的位置。切割后将细胞洗下，离心，加入裂解液提取蛋白。3、组织总RNA提取：购买组织RNA提取试剂盒，分别取冻存的肿瘤及手术切端正常的组织标本提取总RNA。4、组织处理及蛋白提取组织处理：去除组织块上的血液。组织放入研钵中，加入液氮磨碎。加入蛋白抽提液裂解。离心后去细胞碎片及DNA等，吸取含有蛋白的上清，Bradford法测定蛋白浓度，70C储藏待用。（二）异常蛋白质的质谱鉴定1、2DPAGE实验：按正常的2DPAGE流程进行实验，将得到的2D电泳凝胶分别进行银染色或考马斯亮蓝染色。（进行2D实验时采用窄pH范围的干胶条进行

20、等电聚焦能够有效地提高中低丰度蛋白的分离效果，降低碱性蛋白的电渗漂移对等电聚焦的干扰）使用ImagMaster 2-D Elite软件分析2-DE胶扫描图像，在软件分析的结果上利用人工解析，并结合多对组织的分析结果，选择这些组织中变化频率较高的蛋白质点进行质谱鉴定。2、质谱鉴定：选取考马斯亮蓝染色后的2DE凝胶上的差异蛋白点，分别编号，用刀片沿考马斯亮蓝染色边缘切下蛋白斑点，胰酶切割成肽段，脱脱盐后，进行质谱分析，蛋白质质谱的分析包括肽质量指纹分析和多肽的序列测定。分别使用MALDI-TOF MS和LC-ESI-IT MS进行检测。用MALDI-TOF MS分析所得的肽质量指纹图谱在http/

21、上使用Mascot软件进行比对，分值最高且大于规定的有显著性意义分值者为鉴定的目的蛋白。LC-ESI-IT MS的检测标准为Xcorr值大于2.5（三价离子）、2.0（二价离子）、1.5（一价离子）和Cn大于0.1。在此基础上得到的候选蛋白质中，将分值最高且明显高于第二个候选蛋白质的作为鉴定的目的蛋白。（三）异常蛋白质的进一步鉴定：如果上述实验成功，在质谱鉴定结果中会得到多个在肿瘤组织中表达异常的蛋白质。为了提高可信度，通过Western blot、免疫组织化学和RT-PCR等方法，对质谱鉴定的蛋白质在食管癌中的异常表达作进一步的验证和初步的功能分析。

22、1、RT-PCR分析，电泳检测：因为蛋白质的表达由于受到mRNA翻译后的修饰和调节，因此蛋白质水平的上调并不意味着mRNA的上调。RT-PCR从mRNA水平检测上述实验得到的异常蛋白质在食管癌及其癌旁组织中的表达差异情况是否与mRNA水平的变化一致。此检验可以为下一步研究这些异常蛋白质的变异机理及功能提供必要的信息。2、Western Blot分析：选取其他病例，用Western Blot 方法从蛋白质水平分析验证上述实验得到的异常蛋白质在食管癌及其癌旁组织中的表达情况是否与2D-PAGE和质谱分析的结果一致。3、免疫组织化学分析：免疫组化方法既可以结合统计分析手段，在包含大量病例的样本中从组

23、织水平进一步验证质谱鉴定出的蛋白质变异的比例以及与肿瘤发生发展的相关性，进而寻找食管癌进展的指示性标记。还可以观察不同的异常蛋白质之间的共变化情况，为蛋白质的功能研究提供线索。五、预期结果1、在2DPAGE胶上利用软件分析的结果上利用人工解析，并结合多对组织的分析结果应该能够选择出2030个肿瘤组织中明显异常的蛋白质点。2、切割这些蛋白质点进行质谱鉴定并进行数据库检索，应该可以至少找到1020个与蛋白质点匹配的蛋白质。3、如果实验成功，在进一步利用RT-PCR，Western Blot，免疫组织化学等方法验证应该可以证实510种蛋白质在食管癌中存在高频率的异常，接下来可以进一步利用实验所提供的信息进行这些蛋白质的功能研究（如：某两种蛋白质在组织水平的变化存在明显的相关性，则它们很可能处于同一信号通路或存在相互作用。）还可以进一步研究表达异常的原因（如：蛋白质水平的异常如果与mRNA水平一致，则异常变化可能是DNA水平的变化或者转录调控水平的变化导致。而如果蛋白质的水平的异常与mRNA不一致则可能是翻译水平的变化导致的）。另外如果幸运可以从大样本的病例中，在发现的蛋白质中验证出12个指示食管癌进展的分子标记为早期诊断和生物治疗提供线索。六、参考文献1. Hai Hu, Shu-Hua Xia, Ai-Do