分子生物学实验课：2016年硕士实验课

1、分子生物学实验基础,基本实验,主要内容包括 核酸分离提取和定性定量 质粒和RNA提取 电泳 基因扩增和分析 PCR技术 转染和报告系统 细胞转染 荧光素酶报告,核酸制备和分析,最基本的实验技术,一、核酸分离纯化,核酸： DNA为双链线性分子，在细胞中都以与蛋白质结合的状态存在 原核染色体DNA、质粒、细胞器DNA为双链环状分子 RNA：单链线性分子并具有不同的结构特点，如真核生物mRNA分子多数在3端带有polyA结构。,分离核酸 应注意降解影响：,化学降解-酸碱环境 物理降解- DNA的双链刚性 生物降解： DNA酶抑制剂 金属二价离子螯合剂- EDTA-Na2抑制DNA酶活性（DNA酶需要

2、金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活） RNA酶（RNAase)抑制剂 DEPC(二乙基焦碳酸盐) (C2H5OCOOCOOC2H5)（一过性抑制作用，不能使存在于核酸中样本中） RNase阻抑蛋白（RNasin）（可在样本中长期维持）,核酸提取的主要步骤：,一般为破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，沉淀核酸以去除盐、有机溶剂等杂质，最后得到纯化的核酸。,细胞破碎 抽提去蛋白质 沉淀核酸,典型过程,分离提取核酸的主要步骤,细胞的破碎 机械处理 高速组织捣碎机捣碎 玻璃匀浆器匀浆 液氮研磨法 超声波处理 化学处理法(SDS、LDS，吐温80,CT

3、AB等）,核蛋白的解聚、变性蛋白的去除-将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。常用方法： 浓盐溶液（如NaCl）- 核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚（核酸依然溶解） SDS- SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能 酚/氯仿抽提- 酚氯仿混合使用具有去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用（酚：氯：异戊醇=25：24：1） 酸碱度的调整分离DNA和RNA,分离提取核酸的主要步骤,沉淀是浓缩核酸最常用的方法。 应用： 改变核酸的溶解缓冲液； 重新调整核酸的浓度； 去除溶液中某些盐离子与杂质。,分离提取核酸的主要步骤,核酸沉淀

4、-盐法,核酸沉淀-醇类,乙醇 对盐类沉淀少，乙醇易挥发除去 需要量大，一般要求低温操作。 异丙醇 需体积小 异丙醇难以挥发除去 用70乙醇漂 聚乙二醇（PEG） 适于微量珍贵样本,二、定量定性分析,紫外吸收法 特征 变性与复性中的紫外吸收 DNA与RNA特点 荧光染料法 通常结合电泳方法 核酸电泳定性定量,紫外吸收法,嘌呤和嘧啶在260 nm有特异的吸收峰,这个性质用于核酸的分析,DNA分子的变性,DNA双螺旋的有序结构受各种理化因子，如热、酸碱、变性剂、有机溶剂以及稀释的作用，转变为无规则的线团结构。,变性的特征 增色效应, 黏度和比旋下降，沉降系数增加，生物学活性丧失,DNA解链曲线,增色

5、效应(hyperchromic effect) 核酸分子加热变性时，其在260nm处的紫外吸收急剧增加的现象。,Tm值 ：当紫外吸收变化达到最大变化的半数值时，此时所对应的温度称为熔解温度（Tm ）、变性温度或中点解链温度。,3.4 复性,复性：变性DNA分开的两股链在适当条件下重新生成双链结构的过程 退火（annealing）:热变性的DNA经缓慢冷却复性的过程。,在波长260nm紫外光下，1 OD值的吸光度相当于双链DNA浓度为50g/ml；单链DNA为37 g/ml；RNA为40 ug/ml。 纯度分析 纯DNA样品 OD260/OD280应为1.8 纯RNA样品 OD260/OD280

6、应为1.7-2.0 小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染； OD260/OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。,测定结果分析,原理：DNA、RNA本身并不产生荧光，但在荧光染料溴乙锭(EB)嵌入碱基平面之间后，DNA样品在紫外光激发下，可发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使用一系列已知的不同浓度DNA溶液作标准对照，可比较出被测DNA溶液浓度。 注意，此法的特点：解决了紫外法无法判断变性和降解干扰数据的问题（样本保存）。尤其是结合核酸电泳，实际判断意义更为重要！,溴乙锭荧光法,核酸的保存,DNA DNA样品溶于pH8.0的TE，4 或-2

7、0 保存； 长期保存样品中可加入1滴氯仿。 RNA RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或双蒸灭菌水中，-70 保存; 长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中; 在RNA溶液中，加RNASIN冻贮于-70,可保存数年。,凝胶电泳是分子克隆的中心技术之一。 1. 琼脂糖凝胶用于分离大于2001000bp的片段; 操作简单、快速，且分离范围广 2. 聚丙烯酰胺凝胶用于分离5500bp的片段; 效果好、分辨率极高，相差1bp的DNA片断就能分开，能容纳相对大量的DNA 用于核苷酸多态性的分析，测序,三、核酸电泳,影响DNA在凝胶中迁移速率的因素：,1 DNA分子的大小 2 构象 3 凝

8、胶浓度 4 电压 5 缓冲液,琼脂糖是一种线性多糖聚合物。 浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。,仪器和试剂,仪器 电泳仪 电泳槽 灌胶模具等,Tris-硼酸（TBE） Tris-乙酸（TAE） Tris-磷酸（TPE）,常用电泳缓冲液,电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。 作用： 增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。 形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。 使样品呈色，使加样操作更方便。,上样缓冲液,溴化乙锭（EB） 是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与DNA的含量成

9、正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。 琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般5ng。,核酸染色剂,注意事项： EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。,DNA分子量标准,琼脂糖凝胶电泳的基本过程,材料：电泳缓冲液（常用TAE或TBE）、电泳级琼脂糖、溴化乙锭溶液（核酸显示剂）、加样缓冲液（保证核酸不在加样孔中扩散和用于电泳时间的指示系统）、水平凝胶电泳装置及制胶系统、直流电源系统。 基本过程：制胶 放入电泳槽中并加入电泳缓冲液 取出梳子 将适量的核酸样品和上样缓冲液混合并上样于加样孔中 一定电压条件下电泳 合适的时间后停止电泳 取出凝胶进行溴化乙锭染色 凝胶成像系统紫外灯

10、下观察并照相保存结果,琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡过程中 DNA Ladder的形成,PCR产物的琼脂 糖电泳,聚丙烯凝胶电泳的银染结果分析,基本过程同DNA电泳一样，但应明确一点的是，因为RNA分子对RNA酶的作用非常敏感，因此必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水来配置所有溶液，所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理以尽量减少RNA酶对样品的降解；另外，因为RNA分子有二、三级结构可以影响其电泳结果，因此电泳时应在变性剂存在下进行，常用的变性剂为甲醛和戊二醛。,RNA 电 泳,PCR技术,PCR (Polymerase chain reaction) 是用一对寡聚DNA作为引物，通过加温变性

11、退火DNA合成这一周期的多次循环，使目的DNA片段得到扩增。由于这种扩增产物是以指数形式积累的，经2530个循环后，扩增倍数可达106-9。 Dr. Karry Mullis 1985年发明，获1993年度诺贝尔化学奖；,目的: 用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。,PCR的类型,巢式PCR 原位PCR 多重PCR 定量PCR 不对称PCR 差异显示PCR 共享引物PCR 重组PCR 锚定PCR (十一)RT-PCR 彩色PCR (十二)RAPD - - - - - - - - - -,多重PCR:是指在一个单一反应中同时扩增多个序列的反应过程，能够节省时间和精力（可彩色）。 定量PCR

12、技术是指以外参或内参为标准,通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测,进行PCR起始模板量的定量。用于扩增已知一端序列的目的DNA,基本概念,巢式PCR：利用两套PCR引物对进行两轮PCR扩增反应组成，在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在在内引物的存在下进行第二轮扩增。 RT-PCR：测定RNA 差别显示和RAPD：利用随机引物扩增并进行样本间比较,基本概念,（1）DNA模板的热变性 将待扩增DNA加热到940C左右，使双链DNA解开成为单链，并游离于反应体系中作为模板。 （2）模板与引物的结合（退火或复性） 将体系温度降至合适温度（520C左右），使加入的引物与模板DNA两端（

13、3端）碱基序列互补结合。,（3）引物延伸 将体系温度升到720C左右，Taq聚合酶催化dNTP 按碱基互补原则连接在DNA引物3端，使链延伸， 形成两条与模板互补的新链。 以上为1次PCR循环（变性、复性和延伸） （新合成的链可作为下一轮循环的模板） 按照上述（变性、复性和延伸）3个步骤反复循环 ，PCR产物呈指数扩增。 模板DNA 扩增倍数T=2n (n: 循环次数)。,2. PCR各要素及其作用 （1） 模板 PCR模板可以是DNA或RNA。 以线性DNA模板为佳，量适中，一般为102105个拷贝； RNA作为模板时，需要： RNA cDNA PCR, 称此为RT-PCR. （2）耐热DN

14、A聚合酶(Taq DNA聚合酶) 是从耐热细菌体内提取的一种DNA聚合酶，可在95稳定30分钟。从而保证PCR在94变性 52退火72延伸循环30次过程中不变性失活。,逆转录,（3）引物 引物是根据已知序列的模板DNA待扩增区两端而设计的一对寡核苷酸小片断，长度一般为1530个碱基。 引物是保证PCR扩增产物的大小和特异性的关键因素，其设计与合成对PCR的成功至关重要。 引物设计原则如下：,引物设计应符合以下基本原则： 长度适宜，一般为1530个碱基； G+C含量，一般为4060； 4种碱基应随机性分布； 引物自身不应存在互补序列； 两个引物之间不应有多于4个碱基的互补； 引物3端不应有任何修

15、饰； 引物5可以修饰。,47,（4）缓冲溶液与Mg2+ PCR技术常用1050mmol/L Tris-HCl、Ph8.38.88、偏碱缓冲液；并含有一定量的Mg2+浓度； （5）dNTP浓度 PCR一般用50200mol/L的dNTP；并且4种dNTP浓度应相等；,（6）参数 变性温度与时间 一般选择： 940C， 30秒 退火温度与时间 取决于引物长度、浓度 和G+C含量， 一般选择： Tm - 5 延伸温度与时间 一般选择： 70 75 循环次数 取决于模板浓度， 一般循环：30次,49,PCR操作 各种PCR反应的操作基本相同，只是根据引物与靶序列不同，选择不同的反应体系和循环参数。 将

16、PCR反应管置于DNA自动化热循环仪上，输入各种循环参数，使DNA扩增在热循环仪上很方便地完成。 PCR技术优点 特异性强、灵敏度高、操作简便、省时，对样本质量要求不高，能快速、特异地扩增任何DNA片断。 PCR缺点 由于高灵敏度，使易出现假阴性或假阳性结果。,50,PCR产物分析 凝胶电泳分析法 可用琼脂糖（Agrose）或聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳检测PCR扩增产物的大小。 同时应以标准DNA分子量作平行对照，凝胶中加入溴化乙锭，电泳后，紫外检测仪下观察结果并拍照。 （在待检靶序列拷贝数多、且仅扩增出一条带时，用此法即可满足检测要求。）,PCR技术的应用,基因检测： 基因克隆化 DNA

17、突变 DNA序列分析,实时定量PCR real-time PCR,通过特定设计的PCR仪来实时监测PCR扩增过程每一轮循环产物的累积数量，可以很好的推算模板的起始浓度。这种工作方式就成为实时定量PCR。 实现了PCR从定性到定量的飞跃,两种定量化学 探针标记 TaqManTM 特定的聚合酶 染料染色 SYBR Green I,一条探针，两条引物 引物位于探针的两边 一条探针，两个基团 前边是报告基团，后边是淬灭基团,TaqMan探针,每产生一条DNA链，就切断一条探针 每切断一条探针，就产生一个单位信号 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比,数量关系,探针法的优点,与DNA结合时发光,游离时

18、不发光,SYBR Green I,是一种DNA小沟结合染料,在PCR过程中染料与DNA结合发光,聚合完成,聚合开始,SYBR Green I,每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去 染料一结合，就产生荧光信号 信号强度与DNA分子总数目成正比,数量关系,分子生物学技术,基因重组,DNA克隆 也称基因克隆或基因工程是指在体外对DNA分子按照既定的目的和方案，对DNA进行剪切和重新连接，然后把它导入宿主细胞，从而能够扩增有关DNA片段，表达有关基因产物，进行DNA序列分析，基因治疗，研究基因表达的调节因子（如启动子、增强子等），以及研究基因的功能等。,二、重组DNA技术基本原理及操作步骤

19、,重组DNA技术中常用的工具酶,载体,功能 克隆载体: 克隆一个基因或DNA片断 表达载体: 用于一个基因的蛋白表达 整合载体: 把一个基因插入到染色体组中,载 体,来源： 质粒载体 噬菌体载体 柯斯质粒载体 真核细胞克隆载体,载体的种类和特征,一、质粒的生物学特性： 1、质粒DNA的构型： SC型 共价闭合环形DNA（cccDNA） OC型 开环DNA（ocDNA） L 型 线性DNA（cDNA） 2、不同质粒的分子量大小差异相当显著： 106108D 3、作为载体的质粒都含有三种共同的组分： 复制基因（replicator）、选择性记号、克隆位点,L,OC,SC,6、质粒DNA的复制类型：

20、 低拷贝的质粒（13）：严紧型复制控制的质粒 （接合型） 高拷贝的质粒（1060）：松弛型复制控制的质粒（非接合型） 7、质粒的不亲合性 在同一个大肠杆菌细胞，一般不能同时含有两种不同的。也称为质粒的不相容性。 是指在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。 质粒的不亲合性分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。,质粒的拷贝数 质粒拷贝数一般与其分子量成反比关系： 质粒拷贝数=质粒DNA量/染色体DNA量MWc/MWp 质粒的不相容性（incompatibility） 在没有选择压力的条件下，两种不同质粒不能共存于同一宿主细

21、胞内的现象。 不相容质粒携带复制子基本相似，复制系统也相同，在复制和分配到子细胞的过程中相互竞争。,克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。,2、质粒的拷贝数及分子的大小 插入分子量大的外源DNA会引起质粒拷贝数的下降。,(4)表达型的质粒载体,表达载体： 按特殊设计构建的，能使克隆在其中特定位点的外源真核基因的编码序列，在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体。,主要包括：大肠杆菌的启动子、及

22、操纵位点序列、多克隆位点、转录及转译信号、质粒载体的复制起点及抗菌素抗性基因。 待表达的真核基因编码序列被克隆在紧挨于启动子下游的多克隆位点上，而且必须是其编码的蛋白质氨基酸末端这一头靠近启动子方向插入，才能在启动子控制下进行有效的转录。,载体DNA,目的基因,限制酶或机械剪切,限制酶,5 3,3 5,3 T(T)nT,T(T)nT 3 5,5 3,3 5,5 3 A(A)nA,A(A)nA 3 5,-核酸外切酶,-核酸外切酶,末端转移酶 + dATP,末端转移酶 + dTTP,受体菌条件 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent),导入方式 转化 (transforma

23、tion) 转染 (transfection) 感染 (infection),（四）重组DNA导入受体菌,转化（transformation） 转化是指将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。转化常用的宿主细胞是大肠杆菌。大肠杆菌悬浮在CaCl2溶液中，并置于低温（05）环境下一段时间，钙离子使细胞膜的结构发生变化，通透性增加，从而具有摄取外源DNA的能力，这种细胞称为感受态细胞（competent cell）。,质粒载体筛选方法,插入失活 互补：IPTG,X-GAL 直接筛选：抗生素 表达筛选（抗体筛选） Probe筛选,质粒载体缺点,aCl2转化效率低 克

24、隆片段小于kb 大量筛选时需要细胞裂解,4. DNA重组体的鉴定,外源DNA片断是否插入载体构成重组DNA分子，而插入片断大小，是否突变及插入位置，顺序及方向则关系到构建载体是否扩增，我们所需要的基因或表达，表达相应的产品，所以需要进一步鉴定DNA重组体 （1） 酶切鉴定是必需的，基于下述: A. 限制性图谱个体特异性，不同的载体或DNA分子物理图谱不同，酶切后片段大小不一样，电泳图谱不一样。 B. 同一载体连接不同的DNA片断，不同的载体连接同一片段(片段上也有位点）酶切图谱是不同的 。 C. 插入法(单酶单切点)或替代法(双酶双位点)酶切，一般来说用3种限制酶切： 可鉴定载体及 插入片段的

25、大小,方向,切后并电泳分析,以确定是否得到预期的rDNA。,（2）若构建DNA重组体是为了克隆某个基因，可进行在序列测定。 （3）若构建表达载体，可进行表达产物鉴定。,蓝-白筛选（互补） 许多载体（如M13系列、pUC系列、pGEM系列）都含有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和氨基端145个氨基酸的编码信息。这个编码区中插入了一个多克隆位点。这种载体适用于可编码-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细胞。宿主和载体编码的片段各自均无酶活性，但它们可以互补形成具有酶学活性的蛋白质。这种现象称为互补。, 互补的检测,-互补蓝白筛选,原位杂交,实验十二 DNA的连接与转化,1.分子的体外连接 2的转

26、化及转化子的筛选,一实验目的及背景,当我们已经获得目的基因片段，选择好适当的克隆（或表达，转化）质粒载体， 并确定重组方案后，下面要进行的就是片段之间的体外连接，从而获得重组子。 此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的基因的扩增以及目的基因表达（如现代基因工程药物的生产），还可用于序列分析和转基因等重要生物技术的研究中。,1、分子的体外连接,分子的体外连接就是在一定条件下， 由连接酶催化两个双链片段组邻的端磷酸与端羟基之间形成磷酸酸脂键的生物化学过程， 分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进行的。,连接反应中值得注意的几个问题：,1.连接酶 常用的连接酶有两种： (1)来自大肠杆菌的

27、连接酶 (2)来自噬菌体的连接酶。 二者的作用机理类似。,连接酶作用机制,连接酶作用分三步： 连接酶与辅助因子形成酶复合物。 酶复合物结合到具有磷酸基和羟基切口的上，使腺苷化。 产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来.,2.连接反应的温度,连接酶的最适反应温度为， 但在此温度下， 粘性末端的氢键结合很不稳定，折衷方法是过夜。,3. DNA的平未端和粘性末端,由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性末端，因而连接反应中就有平未端连接和粘性末端连接。 二者连接效率不同。 粘性末端效率高，因而在底物浓度，酶浓度选择上是有差异的，,4.碱性磷酸酶处理质粒载体,为了提高连接效率，一般采取提高的浓度，增加重

28、组子比例。这样就会出现自生连接问题， 为此通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其末端的磷酸基，防止环化， 通过接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。见下图。,5.连接反应的检测,连接反应成功与否，最后的检测要通过下一步实验，转化宿主菌， 阳性克隆的筛选来确定。 我们下面的实验从粘性末端为例操作。,2的转化及转化子的筛选,一实验目的及背景 体外通过基因工程手段所构建的含目的基因的重组质粒，选用转化和筛选技术， 可获得含重组的阳性克隆。在此阳性克隆中，可在生物体系中大量扩增，繁殖， 保存以及表达目的基因的产物，这是体外扩增所不能替代的。配合重组技术，所获得的，不同目的需要的阳性菌株已广泛应

29、用于科研，医药生产和生物发酵等领域。,抗生素筛选法,菌株为某种抗生缺陷型， 而质粒上带有该抗性基因（如氨苄青霉素， 卡拉霉素等）这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出。 本实验利用抗生筛选转化子。,互补法,现在使用的许多载体（如系列）有含有一个大肠杆菌的短区段，其中含有半乳糖苷酸基因（lacZ）的调控序列和头个氨基酸偏码区。这个偏码区中插入一个多克隆位点。 受体菌则含编码半乳糖苷酶端的序列。当外源基因插入时，二者溶为一体后，有半乳糖苷酶表达， 在生色底物溴氯吲哚半乳糖苷（x-gal）培养基中形成兰色菌落。 而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入失活，而使lacZ基因不表达而形成白色

30、菌斑。 通过颜色不同而区分重组子和非重组子。,脂质体转染实验与荧光素酶活性检测,目的,了解转染过程。 学习荧光素酶报告基因的原理、检测方法。,报告基因是一种编码某种易于检测蛋白质的基因，通过它的表达产物来标定目的基因的表达调控。该技术的主要优点是高灵敏度、可信性及检测方便且适合大规模检测。,什么是报告基因？,所谓的报告基因（reporter gene）,是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。该基因的表达与插入基因的表达有关。 该技术的主要优点是高灵敏度、可信性及检测方便且适合大规模检测。,理想的报告基因,内源性低,细胞内其它的基因产物 不会干扰报

31、告基因的检测,报告基因编码产物的检测应该 快速、简便、灵敏度高并且重复性好,Reporter,荧光素酶报告基因载体,常用的萤光素酶报告基因载体： 萤火虫萤光素酶报告基因载体 海肾萤光素酶报告基因载体 pGL2 , pGL3 , pGL4 萤火虫荧光素酶报告基因：萤火虫luc以其高度的灵敏性和很宽的线性范围而成为哺乳动物细胞中使用最多的报告基因。 本次所用载体： promega公司的pGL3-promoter 所用质粒： pGL3-promoter-ERE(雌激素应答元件）,与配体结合的ER发生构型改变，被激活形成二聚体，激活的ER二聚体与雌激素应答元件(estrogen response element, ERE)结合， ER- ERE复合物促使转录起始复合物形成并诱导转录。,荧光素酶报告基因简单实验流程：,1、构建载体把调控序列连入到含有萤火虫 萤光素酶（luc）或海肾萤光素酶（Rluc） 的载体中 2、转染 3、提供刺激 4、检测荧光,报