高效菌筛选方法及策略.ppt

1、第三章 高效有机物降解菌的构建 技术及策略,第一节 高效有机物降解菌的构建技术 一、传统分离及驯化技术 二、诱变技术 三、细胞融合技术 四、基因重组技术 五、基因工程,第三章 高效有机物降解菌的构建技 术和策略,第二节 高效有机物降解菌的构建策略 一、优化污染物的降解途径 1.重组互补代谢途径 2.改变污染物代谢产物流向 3.同源基因体外随机拼接 4.拓宽氧化酶的专一性 二、提高污染物生物可利用性 1.重组表面活性剂编码基因 2.重组污染物跨膜转运基因 三、增强细菌的环境适应性 1.增强细菌的抗毒能力 2.增强细菌的放射线耐受性,第一节 高效有机物降解菌的构建技术,一、传统分离及驯化技术 不经

2、人工诱变，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育或自然分离。 微生物自然突变有两种原因： (1)自然环境中存在的低剂量的宇宙射线、各种短波辐射、低浓度的诱变物质和微生物自身代谢产生诱变物质的作用引起的突变； （2）在DNA的复制过程中所发生的错配。,一、传统分离及驯化技术,来源：土壤、水、空气、动植物极其腐败残体、有机物污染地区、污水处理系统中。 采样 增殖培养 纯种分离 筛选 性能鉴定,一、传统分离及驯化技术,采样：应根据筛选的目的、微生物分布情况、菌种的主要特征极其生态关系等因素，确定具体时间、地点和目标物。 增殖：为提高分离效率，常以投其所好的原则在培养基中添加特殊的养分，使

3、其所需菌种的数量相对增加。主要是利用不同微生物的生长繁殖对环境和培养基的特殊要求进行富集培养和要求，控制这些条件使之有利于某类和某种微生物，而对其它微生物不利，再对培养时间加以控制，可以达到初步的分离和富集目的。,一、传统分离及驯化技术,纯化：1.菌落纯 2.菌株纯 1.菌落纯：从“种”的水平来说是纯的，其方法有划线分离法、涂布分离法和稀释分离法。 2.菌株纯：较为精细的单孢子或单细胞分离法。 性能鉴定：菌的生长情况、酶活测定、效果测定 自然选育是一种简便易行的选育方法。但自然选育的效率低（10-810-10）。,二、诱变育种,诱变育种是人为地利用物理、化学等因素，使诱变的细胞内遗传物质染色体

4、或DNA的片段发生缺失、易位、倒位、重复等畸变，或DNA的某一部位发生改变(又称点突变)，从而使微生物的遗传物质DNA或其化学结构发生变化，引起微生物的遗传变异。因此，诱发突变的频率远大于自然突变。,诱变过程,出发菌株的选择： 1.选择纯种作为出发菌株，借以排除异核体或异质体的影响； 2.不仅效果好，而且要考虑其它形状，如生长快、营养要求低等； 3.对诱变剂敏感的菌株； 4.选择已经诱变过的菌株。 诱变剂的选择（物理：紫外线、X射线等，化学：碱基类似物，5-氟尿嘧啶；烷化剂，亚硝基胍，甲基磺酸乙酯）要考虑诱变剂本身的特点，如紫外线作用于DNA分子的嘧啶碱基，而亚硝酸主要作用于DNA分子的嘌呤碱

5、基，两者复合使用，突变谱宽，效果较好。,诱变过程,影响诱变效果的因素： 菌种的生理状态：对分裂中的细胞更有效； 细胞悬浮液要求生理状态一致，为分散均匀的单细胞或单孢子悬浮液（一方面分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，另一方面可避免长出不纯菌落）。,诱变过程,诱变剂的剂量：诱变率随诱变剂量的增加而提高，但达到一定程度后，再提高剂量，反而会使诱变率下降，使负变异株多，因此，主张用中等剂量，如75%-80%或更低剂量。 充分利用复合处理的协同效应。复合处理可以将两种或多种诱变剂分先后或同时使用，也可以用同一诱变剂重复使用。复合处理可扩大突变的位点范围，使获得正突变菌株的可能性增大。,筛选过程,特点：

6、发生频率低；随机性大 过程：先初筛，后复筛，测突变菌株性能 诱变育种的基本筛选程序： 出发菌株绝大多数个体死亡，少数存活（存活率）少数突变（突变率）少数正变（正变率）少数降解酶活增加幅度大（增加率）且要求稳定,三. 原生质体融合,原生质体融合 (Protoplast fusion)指在一定选择条件下，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的、遗传性稳定的融合子。 始于1976年，最早是在动物实验中发现的，后来早微生物中得以应用。使细胞间基因重组的频率大大提高了，已大于10-1 （而诱变育种一般仅为10-6 ）。发生基因重组亲本的选择范围更大，可以在不

7、同种、属、科，甚至更远缘的微生物之间进行。,三. 原生质体融合,在有些情况下，两种或多种微生物在共同存在时才能降解某种污染物，单独存在时不能降解该污染物，这可能是因为彼此为对方提供了生长所必须的条件或为对方消除了生长的障碍，使得它们在共存的条件下能够顺利降解环境污染物。 在这种情况下，可以采用原生质体融合技术融合这两种微生物，融合子就会具备两个亲本的基因与优点，能够降解某种环境污染物，这也是目前污染治理工程菌制备的一个主要途径。,三. 原生质体融合,原生质体融合特点： 1 杂交频率较高 2 遗传物质体传递更为完整 3 存在着两株以上亲株同时参与融合形成融合子的可能 4 提高效果的潜力较大,三.

8、 原生质体融合,3.1选择亲株：必须选遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株，而且必须带有可以识别的遗传标记（多为营养缺陷型或抗药性标记）。 3.2原生质体制备：去除细胞壁是制备原生质体的关键，一般采用酶解法去壁。多酶混合除壁效果较好。 影响因素：菌体前处理、菌龄、酶浓度、酶处理温度、PH、渗透压稳定剂（不仅起保护原生质体免于膨裂，而且还有助于酶和底物的结合。 原生质体对渗透压极其敏感，低渗引起细胞破裂。多采用甘露醇、山梨醇、蔗糖等有机物和氯化钾和氯化钠等无机物。稳定剂的浓度一般均在0.3-0.8mol/L之间。,三. 原生质体融合,3.3原生质体融合：融合促进剂：聚乙二醇（PEG，浓度为25%

9、40%）可有效促进原生质体融合。 另外，紫外线照射和脉冲电场等物理因素处理也能促进原生质体融合。 3.4原生质体再生：是使原生质体重新长出细胞壁，恢复完整的细胞形态结构。可再生的只占原生质体的一部分，细菌再生率为3%10%；真菌为20%80%。用再生培养基。 提高再生率必须避免因强力动作而使原生质体破裂，另外菌液浓度不宜太高。菌龄、再生时的温度、溶菌酶用量和溶壁时间、细胞壁去除程度等因素都会影响再生。,三. 原生质体融合,3.5筛选优良性状融合重组子：原生质体融合后，来自两亲代的遗传物质经过交换并发生重组而形成的子代成为融合重组子。这种重组子通过两亲株遗传标记的互补而得以识别。（真正的融合和暂

10、时的融合） 融合子生理生化测定。 原生质体技术还可用于诱变育种中。,四、基因重组技术,1.转化 受体菌直接吸收了来自供体菌的DNA片段，通过交换，把它整合到自己的基因组中，再经复制就使自己变成一个转化子。 在原核生物中，转化是一个较普遍的现象。能进行转化的受体细胞必须处于感受态（受体细胞最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态）。 感受态因子是一种胞外蛋白。 可能是细胞膜上的一种组成，催化DNA吸收 据推测 可能是一种自溶酶,1.转化,转化因子 本质：DNA 大小：占细菌核染色体组的0.3%，含15个基因。 转化频率：0.1%1%，最高达10%。 呈质粒形式的转化因子，其转化频率最高，

11、因为它进入受体菌后，可不必同受体染色体进行交换、整合即可进行复制和表达，一般认为转化因子都是线状双链DNA。,过程： 1）双链DNA片段与感受态受体细胞表面的特异位点结合； 2）在吸附位点上的DNA被核酸内切酶分解，形成片段； 3）一条单链被膜上的另一种核酸酶切除，另一条单链逐步进入细胞； 4）DNA片段与受体细胞核染色体组上的同源区段配对，交换、整合和取代，形成杂合DNA片段； 5）受体菌染色体复制，一个为转化子，一个不是。,1.转化,2.转导,通过转导噬菌体的媒介，把供体细胞的DNA小片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象。,2.传导,通过完全缺陷噬菌体

12、对供体菌任何DNA小片段的“误包”，而实现其遗传性状传递至受体菌的传导现象。 完全缺陷噬菌体：当噬菌体在供体菌内增殖时，宿主的核染色体组断裂，待噬菌体成熟与包装之际，极少数噬菌体的衣壳与噬菌体头部DNA芯子相仿的一小段供体菌DNA片段误包入其中，形成了一个不含噬菌体自身DNA的假噬菌体。 进行完全普遍传导和流产普遍传导,2. 传导,完全普遍传导：完全缺陷噬菌体将外源DNA导入受体细胞，该片段可与受体细胞核染色体组上的同源区段配对，再经过双交换而整合到受体菌染色体组上，使后者成为一个遗传性状稳定的转导子。 流产普遍传导：经转导而获得的供体菌DNA片段的受体菌，如果外源DNA在其内不进行交换、整合

13、和复制，也不迅速消失，而仅进行转录、翻译和性状表达。,3、接合,供体菌（雄）通过其性菌毛与受体菌（雌）相接触，前者传递不同长度的单链DNA给后者，并在后者细胞中进行双链化或进一步与核染色体发生交换、整合，从而使后者获得供体菌的遗传性状的现象。 F因子：决定性别的质粒,五.基因工程技术,基因工程是分子水平上在生物体外用人工方法进行的重组，以改变生物的性状创造生物的新品种或新物种的一门新学科。 对于环境中难以降解的有毒有害化合物，可通过基因工程的方法，设计新的代谢途径，利用相关的基因构建工程菌。这样不仅提高细胞单一酶的浓度增加代谢途径中某一限制酶的表达，还能使代谢途径中所有基因的表达获得同步增加，

14、从而大大提高降解效率，促使有毒化合物分子进一步降解为无害的末端产物。,五.基因工程,主要过程： 获得特定的目标基因 目标基因片段 DNA重组 载体 DNA进入受体细胞并扩增、表达 具目标基因表达功能重组体,1、限制性核酸内切酶,限制酶是在生物体(主要是微生物)内的一种酶，一种限制性内切酶只能识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开（切割DNA分子）,来源：主要从原核细胞分离 作用：,作用结果：,EcoRI,基因工程的“专用工具”,平未端及粘性未端,什么叫黏性末端？,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互

15、补配对，这样的切口叫黏性末端。,要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？,要切两个切口，产生四个黏性末端。,如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？,会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。,基因的针线：DNA连接酶,基因的针线DNA连接酶,DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来(形成磷酸二酯键)，这样一个重组的DNA分子就形成了。,导入过程需要运输工具运载体。,运载体的作用有哪些？,作用一：作为运载工具，将外源基因转移到受体细胞中去。 作用二：利用运载体在受

16、体细胞内，对外源基因进行大量复制。,（一）载体,基因克隆载体条件： （1）具有能使外源DNA片段组入的克隆位点。 （2）能携带外源DNA进入受体细胞或游离在细胞质中进行自我复制，或整合到染色体DNA上随DNA复制而复制。 （3）必须具有遗传标记，承载外源DNA的载体进入受体细胞后，以便筛选克隆子。,常用的运载体主要有两类： 1）质粒 2）噬菌体或某些动植物病毒,质粒,1.质粒的定义 ：一般来说符合以下 3条标准的染色体外的DNA或RNA分子都可以称之为质粒：(1)质粒是染色体外能自主复制的遗传因子；(2)不具备胞外期的感染性 ；(3)它对宿主来说不是必需的。构建质粒载体一般选用分子小和松弛型复

17、制的质粒。 松弛型质粒在宿主细胞内可含10200个拷贝，而且不受宿主细胞蛋白质合成的影响，当宿主细胞蛋白质合成停止时，质粒DNA的复制仍可以继续进行，甚至可以将拷贝数增加至数千个。 细菌对环境中的特异性限制因子的应答能力一般是由质粒控制的，因此，质粒在为宿主细胞提供遗传多样性及其利用大范围生态位的适应中起着非常重要的作用。,大肠杆菌的质粒：,最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中常含有抗药基因，如抗四环素的标记基因。质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用，但复制只能在宿主细胞内完成。,质粒的生物学特性,质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种，,五. 基因工程,质粒的大小一般为染色体

18、的0.05%20%或更多，长度为 120kb，有时细菌中含有大小不同的质粒。 质粒可以以不同的方式在细菌的种群中传递，转移的频率大到102,而染色体的转移频率却只有106108。 假单胞菌中，发现有分解功能的质粒，带有这些质粒的菌表现为具有降解非正常碳源，如樟脑、辛烷、水杨酸等的能力。质粒的消除试验则是鉴定质粒功能的又一重要手段，通过消除质粒来观察寄主细胞是否丧失某些性状。,五. 基因工程,2.质粒的基本性质 1）细菌质粒是双股的共价闭合环状DNA分子，即cccDNA。 2）每一种质粒有自己特定的核苷酸序列，所以每一种限制酶对每一种质粒都有固定的切点数和切点位置。 3）质粒都有自主复制功能。

19、4）不仅能自主复制，而且能平均分配到两个子细胞中，从而使质粒能稳定遗传。 5）具有不相容性。 6）都具有一定寄主范围。,五. 基因工程,2.质粒的基本性质 7）对寄主细胞是非必须的。 8）质粒DNA能通过转化作用引入到细菌细胞。 9）某些质粒为一些特殊的表型编码，可称抗性质粒、代谢质粒和毒素质粒等。 10）分子量大的质粒一般具有接合功能，即借助于细胞间接触，供体菌的质粒可以转移至受体菌中。 11）有些质粒可以以游离于寄主染色体和与染色体整合两种状态存在。 12）质粒可用作基因载体。,质粒pBR322,pBR322 4363,结构： （1）氨苄青霉素抗性基因（ampr或Apr） 3种限制酶单一识

20、别位点 。 （2）四环素抗性基因（tetr或Tcr） 内部有7种，启动区内有2种限制酶单一识别位点 。 （3）DNA复制起点（ori）,pBR322质粒的优点： （1）具有较小的分子量。 4363bp，2.6106Da， （2）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。 （3）具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后,每个细胞中可累积10003000个拷贝。 （4）对多种常见的限制性内切核酸酶只含有一个能切割的位点。,pBR322 4363,五. 基因工程,3.质粒的生态遗传学意义 质粒有着重要的生态遗传学意义，它们作为“微染色体”能从一个细胞中方便地分离出来，并方便地转入到另一个细胞中去，

21、这一特征为现代生物学的发展提供了重要的工具和手段。在 DNA克隆方法学的发展进程中，质粒起着至关重要的作用，以质粒作为运载体在细菌中扩增和表达许多外源基因的方法和技术，在工、农、医各个领域中都得到了广泛的应用，并极大地拓展了人们对质粒微生物学认识的视野。,五.基因工程,4、载体和目的基因重组 4.1以质粒为载体的重组 质粒是最常用的载体。优点：分子量小，可自主或半自主复制，有多个选择性标记，多个酶切位点，拷贝数多，性能稳定。可隆的最大DNA片段一般在10kb左右。 4.2以噬菌体为载体的重组 先把降解性基因克隆进噬菌体内，将重组经体外包装成成熟噬菌体颗粒，从而能够按照正常的噬菌体感染过程导入寄

22、主细胞。其优点在于克隆效率较高，降解性基因整合进寄主染色体后比较稳定。缺点是包装限制问题，对于片段大于 2 3降解性基因则不能成功地被克隆。,四个基本步骤：,（三）基因操作的基本步骤,1）提取目的基因 2）目的基因与运载体结合 3）将目的基因导入受体细胞 4）目的基因的检测和表达,目的基因是人们所需要转移或改造的基因。,如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、降解有机物的降解基因等。 目的基因：包括转录的启动区、基因编码区和终止区的全功能基因。,步骤一：目的基因的提取,目的基因的提取方法,直接分离基因 人工合成基因,反转录法 根据已知的氨基酸序列合成DNA,：鸟枪法,

23、在获取真核细胞中的目的基因时,一般用人工合成基因的方法.,哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？,1）DNA序列自动测序仪： 2）PCR技术：,对提取出来的基因进行核苷酸序列分析。,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。,步骤二：目的基因与运载体重组,1）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。 2）用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。 3）将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）,目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。,基因操作的基本步骤,目的基因导入受体细胞的方法 1、将

24、细菌用CaCl2处理，以增大细菌细胞壁的通透性。 2、使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。 3、目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,将目的基因导入受体细胞的原理,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,步骤三：目的基因导入受体细胞,第三步：将目的基因导入受体细胞,导入过程：运载体为质粒，受体细胞为细菌,受体细胞：细菌,细胞壁的通透性增大,重组质粒进入受体细胞,目的基因随受体细胞的繁殖而复制,氯化钙,大量的目的基因,步骤四 克隆子的筛选和鉴定,目的基因导入受体

25、细胞后，真正获得目的基因并能有效表达的克隆子只是一小部分。 1 利用克隆载体携带的选择标记基因筛选克隆子。 A 利用抗菌素抗性基因进行筛选 Ampr （抗氨苄青霉素） Cmpr （抗氯霉素） kanr （抗卡那霉素）Tetr （抗四环素） Strr （抗链霉素）。 当含任何一种抗菌素抗性基因的载体处理不具这种抗性基因的受体细胞，并在含相应抗菌素的培养基上培养时，只有获得载体的受体细胞才能继续生长，这样便可筛选出含克隆载体的克隆子。,外源DNA,pBR322 4363,PstI酶切,PstI酶切,黏性末端,黏性末端,连接酶,重组子(ampstetr) 空载体(amprtetr),野生型的E.co

26、li (ampstets),导入,涂布在含Tc的平板上,重组子转化子(ampstetr) 空载体转化子(amprtetr),影印在含Ap的平板上,空载体转化子(amprtetr),因插入外源DNA而导致基因失活的现象称之为插入失活效应,对比两个平板上的菌落，凡在Tc平板上生长而在Ap平板上不能生长的菌落则是重组质粒转化子克隆，挑选阳性克隆，分离出重组质粒。,克隆子筛选与鉴定,B 利用乳糖操纵子lacZ 基因筛选克隆子 具有完整乳糖操纵子的菌体能翻译-半乳糖苷酶（Z）、透性酶（Y）和乙酰基转移酶（A），当培养基中含有X-gal （5-溴-4-氯-3-吲哚- -D-半乳糖苷）和IPTG（异丙基硫代

27、-D-半乳糖苷）时，可产生蓝色沉淀物，使菌落成蓝色。当目的基因插入后lacZ 基因不能表达，因此，带有目的基因的重组子菌落呈白色，而没有转入目的基因的菌落呈兰色。,克隆子筛选与鉴定,2 克隆子的进一步鉴定 用上述方法筛选的克隆子，难免得到一些假克隆子，为进一步鉴定克隆子的真假，可采用限制性内切酶分析、分子杂交、PCR扩增和DNA测序、目的基因转录及翻译产物检测等方法。,第二节 基因工程菌构建策略,自1973年Jackson等人首次提出基因可以人工重组，并能在细菌中复制以来，基因工程作为一个新兴的研究领域得到了迅速发展，取得了喜人的成绩。 因各种环境条件和生物因子的限制，细菌的进化是相当缓慢的而

28、且没有一定的方向，因此通过基因工程促进细菌的遗传进化以满足生物修复工程的需要。,1.优化污染物的降解途径,（1）重组互补代谢途径： 系列酶（不同菌共代谢） 有机污染物 小分子化合物 缺点：降解速率慢，因为污染物代谢产物在不同降解菌间的跨膜转运是耗能过程，对细菌来说这是一种不经济的营养方式。另外，某些污染物的中间代谢产物可能具有毒性或对代谢活性有抑制作用，如不能被迅速代谢利用，积累后将对整个代谢过程产生抑制作用。 因此对这些细菌的降解基因进行重组，将分属于不同细菌个体中的污染物代谢途径组合起来来构建具有特殊降解功能的超级降解菌，可以有效的提高微生物降解能力，从而提高生物修复效率。,抑制剂 脱氯

29、ohb 脱卤素基因 联苯双加氧酶 （bph A） 氯代苯甲酸(CBA) 多氯联苯 （PCBs） O2 异戊二烯酸 重组体Bph:ohb CO2 +H2O,进一步降解,硝基芳香化合物，如炸药，即2，4，6-三硝基甲苯（简称TNT） 引入甲苯完整降解质粒pWWO-Km 假单胞菌 甲苯 TNT 氨基甲苯 硝基甲苯 构建微生物可以利用TNT 为唯一碳源和氮源生长,1.优化污染物的降解途径,（2）改变污染物代谢产物流向 污染物降解过程中由于抑制性中间代谢产物的生成或中间产物进入截止式代谢产物途径而抑制了污染物降解酶活性，使得污染物降解效率不高或降解不彻底。因此可以考虑将细菌对污染物的中间代谢产物流向进行某些改进，使抑制性中间产物不产生或尽量转化，从而提高污