脂质体新剂型.ppt

1、靶向制剂基础 Targeting Preparations,Introduction,靶向给药系统 (target-oriented drug delivery system,简称TODDS)又称靶向制剂 是借助载体、配体或抗体将药物通过局部给药、胃肠道或全身血液循环而选择性地浓集于靶组织、靶器官、靶细胞或细胞内结构的制剂。,一、TODDS的分类 1. 从药物到达的部位，可分为三级： 第一级指到达特定的器官或组织； 第二级指到达器官或组织内的特定的细胞（如肿瘤细胞而 不是正常细胞，肝细胞而不是Kupffer细胞）； 第三级指到达靶细胞内的特定的细胞器。,一、TODDS的分类 1. 从药物到达的

2、部位，可分为三级： 第一级指到达特定的器官或组织； 第二级指到达器官或组织内的特定的细胞（如肿瘤细胞而 不是正常细胞，肝细胞而不是Kupffer细胞）； 第三级指到达靶细胞内的特定的细胞器。,靶向制剂的设计,1 被动靶向 即自然靶向，药物以微粒给药系统为载体(microparticles drug delivery systems),通过正常的生理过程运 送至肝、脾、肺等器官,（一）被动靶向制剂 迄今，研究最多的被动靶向给药制剂是,Liposomes,Microspheres,Micro- emulsions,Nanoparticles,TODDS 分类介绍,被动靶向制剂经静脉注射后，在体内的

3、分布首先取决于微粒的粒径大小。 通常小于50nm的纳米囊与纳米球缓慢积集于骨髓； 小于7m时一般被肝、脾中的巨噬细胞摄取； 大于7m的微粒通常被肺的最小毛细血管床以机械滤过的方式截留，被单核白细胞摄取进入肺组织或肺气泡。,被动靶向制剂的体内靶向性,TODDS 分类介绍,靶向制剂的设计,2 主动靶向 是指表面经修饰后的药物微粒给药系统，不被单核吞噬系统识别 其上连接有特殊的配体， 使其能够与靶细胞的受体结合；,脂质体 Liposomes,脂质体（liposomes）的概念最早是1965年被英国科学家Banghan等提出的。 当磷脂分散在水中时形成多层囊泡，而且每一层均为脂质双分子层，各层之间被水

4、相隔开。这种由脂质双分子层组成，内部为水相的闭合囊泡称之为脂质体。,一、概述 Introductions,图 脂质体的示意图,脂质体主要由磷脂和胆固醇组成。磷脂由一个亲水的头部和两个疏水的尾部组成。,一、概述 Introductions,常见磷脂的结构示意图,载药脂质体的结构示意图,药物被脂质体包封后有以下特点： 1靶向性和淋巴定向性 2长效性 3细胞亲和性与组织相容性 4降低药物毒性 5提高药物稳定性,一、概述 Introductions,Enhanced permeability and retention (EPR) effect,正常组织中的微血管内皮间隙致密、结构完整,大分子和脂质颗

5、粒不易透过血管壁,而实体瘤组织中血管丰富、血管壁间隙较宽、结构完整性差, 造成大分子类物质和脂质颗粒具有选择性高通透性和滞留性,这种现象被称作实体瘤组织的高通透性和滞留效应,简称EPR效应。,蛋白质的聚乙二醇化,Methoxy Polyethylene Glycol，mPEG,Veronese M. Drug Discovery Today. 2005 Nov; 10(21),PEGylated Molecules,Frank F. Davis,1981,PEG-IFN -2b 1.5 g/kg,浓度 干扰素a-2b (pg/mL),0,20,40,60,80,100,120,1,10,100

6、,1000,IFN -2b 3 MU,140,160,180,周一 周二 周三 周四 周五 周六 周日,未检测到血清干扰素,病毒重新出现,h,Data from EASL 2001: Schering-Plough Research Institute,蛋白质的聚乙二醇化,PEG conjugates already on the market,腺苷脱氨酶,天冬酰胺酶,促红细胞生成素,蛋白质的聚乙二醇化,聚乙二醇化干扰素,半衰期,生物活性,Schering-Plough Corporation, Wyss et al., Current Pharmaceutical Design, 2002,

7、40h,30%,Half-life & activity following PEGylation,Random & Site-specific PEGylation,脂质体在体内与细胞的作用过程:分吸附adsorption、脂交换lipid exchange、内吞endocytosis、融合fusion四个阶段。 吸附是脂质体与细胞作用的开始，受粒子大小和表面电荷等因素影响； 脂交换是脂质体的脂类与细胞膜上脂类发生交换； 内吞作用是脂质体被作为外来异物吞噬，通过内吞，脂质体能特异地将药物浓集于起作用的细胞内； 融合指脂质体的膜与细胞膜融合进入细胞内，然后经溶酶体消化释放药物。,一、概述 In

8、troductions,1中性磷脂磷 磷脂酰胆碱phosphatidylcholine是最常见的中性磷脂。有天然和合成两种来源。与其它磷脂比较，它具有价格低、电中性、化学惰性等性质。 合成的磷脂酰胆碱： 二棕榈酰胆碱dipalmitoyl phosphatidyl choline, DPPC 二硬脂酰胆碱distearoyl phosphatidyl choline, DSPC 鞘磷脂sphingomyelin, SM 磷脂酰乙醇胺phosphatidylethanolamine，PE）。,二、制备脂质体的材料 Materials for preparation of liposomes,2负

9、电荷磷脂 负电荷磷脂又称为酸性磷脂。制备脂质体常用的负电荷脂质有： 磷脂酸（phosphatidic acid, PA）； 磷脂酰甘油（phosphatidyl glycerol, PG）； 磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol, PI）； 磷脂酰丝氨酸（phosphatidyl serine, PS）等。,二、制备脂质体的材料 Materials for preparation of liposomes,3正电荷脂质 正电荷脂质均为人工合成产品，目前常用的正电荷脂质有： 硬脂酰胺（stearylamine, SA）； 胆固醇衍生物等。 正电荷脂质制备的脂质体在基因的传递系统中

10、应用非常普遍。,二、制备脂质体的材料 Materials for preparation of liposomes,4胆固醇 cholesterol 胆固醇（Ch）是自然界膜中的另一类重要的组成成分。 它是一种中性脂质，亦属于两亲性分子，但是亲油性大于亲水性。,胆固醇的结构,二、制备脂质体的材料 Materials for preparation of liposomes,5长循环膜材 长循环脂质体是指含有神经节苷脂GM1ganglioside GM1或聚乙二醇Polyethylene glycol, PEG衍生物的脂质体。 神经节苷脂GM1引入了唾液酸残基增强了膜的稳定性、明显减少了网状内皮

11、系统细胞对脂质体的摄取，延长了脂质体的体内循环时间； 极性的聚乙二醇基则增强了脂质体膜的亲水性，减少了血浆蛋白与脂质体膜的相互作用，阻止网状内皮系统细胞对脂质体的摄取，从而也延长了脂质体的体内循环时间。,二、制备脂质体的材料 Materials for preparation of liposomes,脂质体的制备方法很多，常用的有下列几种： 1薄膜法 Film forming method 该法最早由Bangham报道，这是最早而至今仍常用的方法。 系将磷脂等膜材溶于适量的氯仿或其它有机溶剂，脂溶性药物可加在有机溶剂中，然后在减压旋转下除去溶剂，使脂质在器壁形成薄膜，加入含有水溶性药物的缓冲

12、液，进行振摇，则可形成大多室脂质体（multilamellar vesicles, MLV），其粒径范围约1-5m。 然后可用各种机械方法分散薄膜法形成的类脂膜，形成MLV脂质体。,三、制备脂质体的方法 Preparation of liposomes,2逆相蒸发法Reverse-phase evaporation 最初由Szoka提出。一般的制法系将磷脂等膜材溶于有机溶剂如氯仿、乙醚等，加入待包封药物的水溶液（水溶液:有机溶剂=1:3-1:6）进行短时超声，直至形成稳定的WO型乳剂，减压蒸发有机溶剂，形成脂质体。 用逆相蒸发法制备的脂质体一般为大单层脂质体，常称为REVs。 本法特点是包封的

13、药物量大，体积包封率可大于超声波分散法30倍，它适合于包封水溶性药物及大分子生物活性物质如各种抗生素、胰岛素、免疫球蛋白、碱性磷脂酶、核酸等。,三、制备脂质体的方法 Preparation of liposomes,典型脂质体制备过程,称量脂材料， 如 EPC/CHOL/PEG-DSPE =55/40/5 mol/mol/mol 将脂材料溶解 蒸发形成脂膜 水化形成粗脂质体 挤压形成小脂质体（空白或载药脂质体）,典型脂质体制备方法,薄膜法又称干膜分散法 即将脂质材料及脂溶性药的混合于有机溶剂中，通过氮气或减压除去有机溶剂，在容器底壁上形成脂质薄膜； 然后将溶有药物的水溶液加到脂质薄膜上，室温下

14、放置30min使脂质水化，然后在高于Tc 振荡分散脂膜，类脂膜碎片吸水膨胀，形成大多室脂质体。 经超声分散后可形成小单室脂质体。,典型脂质体制备方法,French压力制备脂质体（French press liposomes, FPL） 超声制备脂质体的最大问题是生物材料遭受超声辐射，这样不仅脂质变性，而且包裹在脂质体内的大分子和其它敏感化合物也发生变化性。 目前有几种温和方法使膜破碎和重建。其中之一是将形成的大脂质体放入French压力室，在很大的压力下挤压。这各方法产生直径3080nm单层或寡层的脂质体。 该法适于作为敏感大分子载体，其稳定性比超声制备的脂质体稳定性好。高压挤压对于重组稳定的

15、膜蛋白也是非常有用的方法。 French压力是根据其发明人之一命名的。最初设计用于植物细胞和细菌的的破碎。目前由SLM-Aminco Inc制造, Urbana, Illinois 61801，USA 。 French压力室的中央是压力室，由不诱钢材料制成。能持续耐受137824kPa甚至275684kPa压力，有不同大小的压力室，分别为小于4ml和 40ml。,典型脂质体制备方法,挤压制备脂质体（membrane extrusion） 通过挤压使脂质体通过固定孔径的滤膜，脂质体粒径变小。该方法需要很低的压力，689kPa即可。 过滤膜分两类，一类是用于除菌用膜，它的通道是弯曲的，这些通道的孔

16、径由膜中纤维密度决定，由于通道的弯曲性质，当大于膜孔径的脂质体通过些膜时，膜孔很容易堵塞，脂质体不能到达另一面；另一类是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）,该膜的通道是直的并且大小相同，脂质体容易通过，即使脂质体直径略大于孔径也能通过。一般将脂质体原液稀释至12mol/ml后再过膜，脂质体易通过孔径。 脂质体加压通过孔时，其结构发生变化，根据所需脂质体的大小选择膜的孔径。,3主动包封法 Remote loading method 主动包封法使得制备高包封率脂质体成为可能，从根本上改变了难以制备高包封率脂质体的局面。 但是主动包封技术的应用与药物的结构密切相关，不能推广到

17、任意结构的药物，因而受到了限制。 主动包封法也称为遥控包封装载(remote loading)技术，对于弱碱性的药物可采用pH梯度法、硫酸铵梯度法等，对于弱酸性的药物可采用醋酸钙梯度法等。,三、制备脂质体的方法 Preparation of liposomes,三、制备脂质体的方法 Preparation of liposomes,Passive loading,Active loading,Doxorubicin,pH梯度法包封阿霉素隐形脂质体的原理 前提：（1）分子型药物易穿透脂膜； （2）离子型药物不易穿透脂膜。 普通磷脂材料和PEG材料形成类脂薄膜 用pH（如4）较低的枸橼酸盐缓冲液水

18、化脂膜，形成脂质体 挤压过膜处理使脂质体粒径变小，得空白脂质体混悬液 调节脂质体膜外pH使呈弱碱性（如pH8） 另外取盐酸阿霉素溶于枸橼酸盐缓冲液（pH8），得药物溶液 将空白脂质体混悬液和药物溶液分别于一定温度水浴中（Tc以上）加热片刻，混合，于该水浴中放置10分钟，不时振摇，即得。 这是因为盐酸阿霉素在碱性环境中为阿霉素分子存在，在Tc以上分子型更易穿透脂质体膜，进入脂质体内部后，由于内部呈酸性，又形成枸橼酸阿霉素，以离子型存在，不能再缓回到溶液中，从而包封入脂质体内部。该法可达到95%以上的包封率。,高包封率：遥控装载硫酸铵梯度法包封隐形脂质体,硫酸铵梯度法包封脂质体是根据化学平衡移动原

19、理而设计的，空白脂质体包封阿霉素的前提是： （1）脂质体膜可透过分子型药物； （2）离子型化合物较少或几乎不透过脂膜； （3）硫酸阿霉素的溶度积 盐酸阿霉素的溶度积。,遥控装载硫酸铵梯度法,制备脂薄膜； 用高浓度硫酸铵溶液使脂膜水化（hydration）； 挤压使此混悬液分别通过不同孔径的核子打孔的聚碳酸酯微孔滤膜，较大粒径的脂质体被剪切、“粉碎”成较小粒径的脂质体，这样制备成了空白脂质体。 通过透析法或凝胶色谱柱过滤后，除去脂质体囊泡外部的硫酸铵，从而使脂质体囊泡内、外部的硫酸铵浓度形成了浓度梯度差(如1000倍。 分子型DOXNH2可透过脂质体膜，则在脂质体膜内、外形成如下平衡，见下图。,

20、遥控装载硫酸铵梯度法,4免疫脂质体制备法 免疫脂质体immunoliposomes对靶细胞分子水平上的识别能力，取决于其表面所连接识别分子的特异性结合能力。当将癌细胞特异性单克隆抗体McAb结合到脂质体上，能选择性地杀伤癌细胞。 抗体与脂质体结合方法有： （1）吸附法 （2）脂质蛋白融合法 （3）交联法,三、制备脂质体的方法 Preparation of liposomes,1形态、粒径及其分布 脂质体的形态为封闭的多层囊状或多层圆球。其粒径大小可用显微镜法测定 小于2m时须用扫描电镜或透射电镜。 也可用电感应法(如Coulter计数器) 光感应法(如粒度分布光度测定仪) 激光散射法或激光粒度测定法测定脂质体粒径及其分布。,四、脂质体的表征 Characterization of liposomes,扫描电子显微镜 (SEM) 分辨率: 5nm 放大倍数: 20,0000,透射电子显微镜 (TEM) 分辨率: 0.2nm 放大倍数: 60,0000,P9,原子力显微镜 (