细胞培养(hela, 293,239T等细胞的培养)

1、Hela细胞传代培养操作步骤1观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。观察时拧紧盖子。2加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。3打开超净台（先开风机，后开照明），用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。取小离心管一个，置于架子上。4取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。5取待传代的细胞。打开versene，用酒精灯外焰烧。烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。

2、6用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。（加versene主要是为了将旧培养基洗去）。在离心管中间部分将液体加入。吸液体和加液体时都不要对着细胞。7打开胰酶，然后将versene弃掉。换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。8将细胞放入37度孵箱。放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。别忘了用旧培养基中和。9取细胞，镜下观察消化情况。消化程度合适之后（细胞变圆，但不漂起），用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底

3、部脱落下来。用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。10吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。11细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。12擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。不要把枪伸到离心管内。13吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。镜下观察，摇匀，放入37度孵育。收超净台。293T细胞培养条件：37，5%CO2，PH值7.27.4，无菌恒温培养。细胞相关操作：细胞复苏1.37C水浴预热培养基（DMEM+10%FBS）；2.从

4、液氮中取出细胞迅速放入37C水浴快速解冻（解冻后不要继续暖细胞）；3.在超净台中加入5ml培养基重悬细胞，1000rpm离心5min；4.弃上清，加入5ml培养基重悬细胞后转入T25培养瓶中，轻轻晃匀；5.置于37C，5%CO2培养箱中培养(培养瓶盖没有透气孔的话,瓶盖不要拧太紧)；6.第二天，用新鲜的培养基给细胞换液后继续培养。细胞传代1.当细胞融合度达到90%以上时，给细胞传代；2.37C水浴预热培养基（DMEM+10%FBS）；3.在超净台中，弃培养基，加入2-5mlPBS清洗细胞后，再加入1ml胰酶消化细胞；4.显微镜下观察到细胞变圆，有细胞开始脱离瓶壁时，加入5ml培养基（DMEM+

5、10%FBS）终止消化；5.用移液器轻轻吹下瓶壁上剩余的细胞，并轻轻吹打将细胞吹散；6.将细胞移入离心管中，1000rpm离心5min；7.弃上清，加入15-20ml的培养基（含血清）重悬细胞后转入T75培养瓶中或按适当比例传到T25瓶中（确保细胞贴壁后融合度在25-50%之间），细胞密度在1104cells/cm2(2.5105cells/T-25瓶），混匀细胞悬液，确保细胞均匀分布；8.将培养瓶置于37C，5%CO2的无菌培养箱中培养。细胞冻存1.37C水浴预热培养基（DMEM+10%FBS）；2.消化细胞后给细胞计数:1)洗净晾干血小板计数板和盖玻片，将盖玻片完全覆盖计数区；2)充分混匀

6、细胞，取少量(0.1-0.5ml)细胞悬液与等体积的染色液台盼蓝混合，移液器吹吸混合均匀，用移液器取20ul混合液从盖玻片两端(与中间凹槽平行的两端)分别打入细胞，以细胞悬液刚好浸湿盖玻片为佳；3)显微镜下，数四个计数区的总细胞数，无活性细胞染成蓝色，活细胞不被染色；4)细胞密度=细胞总数/4100002；这里10000是不变的，因为计数的细胞是在体积为1mm1mm0.1mm即10-4cm3计数池内，1cm3=1ml，将四个计数区的细胞数除以4取平均数，乘2是补偿加等体积台盼蓝形成的稀释。5)细胞活性=活细胞数/细胞总数100%。注:细胞密度高时，可调整细胞悬液和台盼蓝的比例，计数时乘以相应的

7、稀释倍数即可。3.当细胞密度达到传代密度且细胞活性在90%以上时，可以冻存细胞。4.在超净台中将要冻存的细胞移入离心管，1000rpm离心5min。5.弃上清，用90%培养液+10%DMSO的混合液重悬细胞，并调整细胞密度为1-3106/ml。6.将细胞悬液分装到冻存管中(1-1.5ml/管)。7.将装有细胞的冻存管放入程序降温冻存盒，-20C放1-2h后，-80C过夜，然后快速转移到液氮中。293细胞培养293细胞培养特性：1、293细胞明显适应酸性环境,pH值在6.97.1时,可顺利贴壁生长,换液时动作要轻。一般用高糖的DMEM培养基。2、传代：倒去废液，PBS洗一次（轻），用0.02%E

8、DTA与0.25%Trypsin消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin作用30s,镜下观察细胞变圆,就可加DMEM终止消化，反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。12小时-24小时90%以上细胞贴壁。293细胞传代时机为达80-90%汇合，传代比例为1：3。3、293细胞在低代时容易贴壁，生长良好，在传到几十代以后，易聚集成团，且贴壁不牢，用PBS冲洗时即可能脱落，即使消化后也不容易吹打成单细胞悬液，最好购入时先大量冻存。4、复苏293细胞的另一生长特性是贴壁所需时间长且贴壁不牢。细胞冷冻后复苏时,都有不同

9、程度的肿胀,若以50ml培养瓶待细胞长满瓶底的70%80%时消化冻存,复苏时将其全部接种至2个50ml瓶中时较为合适。刚复苏的293贴壁很慢，复苏接种后24小时内,应尽量减少观察细胞次数或不作观察,以免因晃动而影响细胞贴壁。复苏后48小时左右观察贴壁情况并进行首次更换培养基比较合适,如果用一次性塑料培养瓶可增加细胞贴壁牢度。换液前宜将培养基预热。5、转染：体外应用293细胞进行细胞转染时，如果是采用磷酸钙转染，一定要注意293细胞不要全部长满细胞培养盘，长满细胞时加入磷酸钙就会使293细胞大片的脱落，最好是当293生长到1/2或2/3时进行磷酸钙转染，可以避免细胞的大量脱落。其它的经验：1、用

10、大瓶培养较小瓶要好，可能是更有利于293均匀的分布，利于营养的摄取2、培养液要新鲜，每次只配1000ml，分为2-4瓶，不用的培养液，冻存在-20度，3、要及时传代，最好是细胞基本铺满培养瓶底部，但是细胞之间还没有完全贴紧，总是多少有空隙的时候最好。4、如果细胞贴壁不好，可能是消化过久，或是培养瓶不够干净，当然要除外细胞污染。5、如果使用用玻璃培养瓶或皿，可以采用高压灭菌的0.2%明胶溶液预处理培养瓶/培养皿，方法是将明胶加入培养皿，使之浸泡到底面的各个部分，然后吸出，置超净台内晾干即可使用。这样处理后细胞贴壁效果好且镜下细胞立体感强。如果是新的塑料培养瓶就不用处理。培养基；GIBCO DME

11、M粉剂，加双抗，HEPES，NaHCO3配置高糖的DMEM培养基1000ml，1.一袋DMEM培养基（GIBCOBRL)用去离子水溶解2.加入NaHCO32.0g3.加入谷氨酰胺0.146g（终浓度为5mM）4.加入青霉素10万U（终浓度100u/ml），链霉素6.5万U（终浓度100u/ml）5.定容900ml6.过滤除菌、分装到两个消毒的500ml瓶子中7.加入灭活小牛血清100ml。Jurkat细胞（人外周血白血病T细胞），是一种悬浮细胞。我的经验如下：1、培养液：RPMI1640，15小牛血清，2Na2CO3，1HEPES，青霉素100IU1ml，庆大霉素100IUml；2、培养条件：

12、5CO2，37度，30湿度；3、细胞复苏：要快速将冻存管放入37度水中，不断轻轻摇晃，直到细胞完全溶解，加入10ml左右的培养液，8001000rpm，10分钟离心，之后倒掉液体，加入新的培养基就可以进行培养了；4、细胞培养：起初进行传代时由于细胞刚刚复苏，长得比较慢，所以可以34天传一代，传过两代后，一般23天传一代，每次传代后在倒置显微镜下观察细胞形态，在传过几代合适的时候可以进行实验。5、细胞冻存：1000rpm离心后，弃去液体，加入含有15DMSO的冻存液，按下列顺序降温：室温4（20分钟冰箱冷冻室（30分钟）低温冰箱（801小时）液氮。培养经验细胞培养箱在每使用1个月最好用酒精擦洗一次，这样可以减少污染；（2）虽然说加样器放在紫外下照射会不准，但我们还是丢了一把1ml的加样器在超净台，没有 拿出来过，我想这样也许会减少污染；（3）小牛血清我们用的是国产的，所以在一开始的时候加了15的小牛血清，但细胞总是长不 好，后来摸索条件，把小牛血清的量调到了20，细胞生长旺盛；（4）HEPES虽然贵点，