DNA的粗提取与鉴定.ppt

1、DNA的粗提取与鉴定,一、课题重点与难点,课题重点：DNA的粗提取和鉴定原理方法。 课题难点：DNA的粗提取和鉴定原理方法。,二、基础知识分析,（一）DNA的提取原理,1、DNA的溶解性,DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,问题思考与讨论：,根据DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线图，思考在什么浓度下， DNA的溶解度最小？ DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何变化的？,当氯化钠的物质的量浓度为 2 molL时，DNA的溶解度最大，浓度为 014 molL时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出,如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶

2、液中溶解或析出？,DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则可以溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步分离,2、DNA在酒精溶液中的溶解性,3、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性,蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响,大多数蛋白质不能忍受6080C的高温，而DNA在80C以上才会变性,洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜，去除脂质和蛋白质,但对DNA没有影响,（二）、DNA的鉴定原理, DNA与二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂,甲基绿 （绿色）,三、DNA的粗提取与鉴定的实验设计,（一）实验材料的选取,1、材料：鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、哺乳动物的红

3、细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。（从中选取23种实验材料）,2、原则：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大,动物细胞的破碎较易，例如，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水 ，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。,（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液,1、动物细胞,讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？,植物细胞需要先用一定的洗涤剂和食盐溶解细胞膜.,2、植物细胞,讨论：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？,答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解,实例

4、：提取洋葱DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液,答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等.,讨论：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？,（三）去除滤液中的杂质,讨论：为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？,答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质.,讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？,答：方案二是利

5、用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开； 方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离.,（四） DNA的析出与鉴定,DNA的析出用的是与滤液体积相等的冷却的酒精溶液（体积分数为95 ） ，静置23min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取DNA。,1、DNA的析出,2、 DNA的鉴定,鉴定DNA时在试管中先加入物质的量的浓度为2mol/L 的NaCl溶液5ml于两只试管中，其中一只加入DNA丝状物，各加入二苯胺4ml 试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min,待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否有蓝色,

6、案例：以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取,三、实验案例,鸡血细胞极易吸水胀破,鸡血细胞做实验材料的原因 ?,鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得,1、准备鸡血细胞液,过程：,柠檬酸钠作用:,讨论：提取鸡血中的DNA时，为什么除去血液中的上清液？,答：血液分为两部分，一部分是血浆，一部分是血细胞，离心后除去的上清液是血浆.,取柠檬酸纳溶液（抗凝剂）100ml，注入新鲜的鸡血（约180ml），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸纳溶液充分混合，以免凝血。,防止血液凝固,2、方法步骤,提取鸡血细胞的细胞核物质 溶解细胞核内的DNA 析出含DNA的粘稠物 滤取含DNA的粘稠物 将DNA的粘稠物再溶解 过滤

7、含有DNA的氯化钠溶液 提取含杂质较少的DNA DNA的鉴定,2、方法步骤,将制备好的鸡血细胞液5 mL10 mL，注入到50 mL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20 mL，同时用玻璃棒充分搅拌5 min，使血细胞加速破裂。然后，用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至500mL。取其滤液。,提取鸡血细胞的细胞核物质,讨论：,答：让细胞内浓度大于周围溶液的浓度，细胞会吸水以至涨破,（1）为什么要加入蒸馏水？加入蒸馏水后细胞会有什么变化？,（2）用玻璃棒搅拌有什么意义？,答：用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA,（3）滤去的是什么物质？得到的是

8、什么？,答：过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质；得到的是与蛋白质等物质结合在一起的DNA,溶解细胞核内的DNA,将物质的量浓度为 2 mol/L的氯化钠溶液40mL加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌1min，使其混合均匀，这时DNA溶解在溶液中。然后，用放有纱布的漏斗过滤，取其滤液。,加入蒸馏水，同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现，注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水（这时氯化钠为0.14 molL）,析出含DNA的粘稠物,讨论：加入蒸馏水的目的？,降低NaCl溶液浓度到使DNA溶解度最低点，使DNA从NaC

9、l溶液中析出.,滤取含DNA的粘稠物,用放有多层纱布的漏斗，过滤步骤中的溶液至 500mL的烧杯中，含 DNA的粘稠物被留在纱布上.,将DNA的粘稠物再溶解,取1个 50 mL烧杯，向烧杯内注入物质的量浓度为 2 molL的氯化钠溶液 20mL。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，用玻璃棒不停地搅拌，使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中.,过滤含有DNA的氯化钠溶液,取1个100 mL烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤步骤中的溶液。取其滤液，DNA溶于滤液中.,提取含杂质较少的DNA,在上述滤过的溶液中，加入冷却的、酒精的体积分数为 95的溶液 50mL（使用冷却的酒精，对DNA的凝集效果较佳）

10、，并用玻璃棒搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是DNA,答：因为DNA不溶于冷酒精，而其他物质可以溶解在酒精中，使含杂质较少的DNA丝状物可以析出,悬浮于溶液中,讨论：,（2）观察丝状物呈什么颜色？,答：白色,（1）为什么要加50mL的冷酒精？,取两支20 mL的试管，各加入氯化钠的物质的量浓度为2 molL的溶液5 mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4 mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热 5 min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化, DNA的鉴定,讨论：,答：有丝状物的试管变成蓝色，另一试管还是原来颜色,（2）这一鉴定结果说明什么问题？,（1）比较两个试管中溶液的颜色有什么不同？,答：提取出的丝状物是DNA,答：整个实验共“两次蒸馏水，四次过滤，两次析出”,6、讨论：,两次蒸馏水,第一次：细胞吸水胀